巖藻聚糖硫酸酯對(duì)高糖培養(yǎng)腎小球系膜細(xì)胞的影響

王秀敏 王允山 宋淑亮 梁 浩 吉愛(ài)國(guó) (山東大學(xué)威海國(guó)際生物技術(shù)研發(fā)中心,山東 威海 264209)

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β1(TGF-β1)是致纖維化因子,是導(dǎo)致糖尿病腎病(DN)時(shí)腎小球硬化的核心因素。Ⅳ型膠原(Col-Ⅳ)作為細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的重要成分之一,是衡量 ECM積聚的主要指標(biāo),在 DN的發(fā)病進(jìn)程中起著重要作用〔1〕。由海帶中提取的巖藻聚糖硫酸酯(Fucoidan,FPS)具有明顯的腎臟保護(hù)作用,已經(jīng)用于尿毒癥早期治療〔2〕。纈沙坦(Val)是血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)受體(AT1)拮抗劑(ARB),為臨床上用于治療 DN的一線(xiàn)藥物。本研究以 Val為陽(yáng)性對(duì)照,觀(guān)察FPS對(duì)高糖培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細(xì)胞(GMCs)增殖和 ECM積聚的影響,為 FPS應(yīng)用于 DN提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 干海帶,購(gòu)自山東省威海市乳山地區(qū)。大鼠腎小球系膜細(xì)胞株(HBZY-1),購(gòu)自武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)。大鼠 TGF-β1ELISA試劑盒:RB公司;大鼠兔多克隆鼠 Col-Ⅳ抗體、鏈霉親合素-生物素-酶復(fù)合物(SABC)免疫組化試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)有限公司;Val,北京諾華制藥有限公司。

1.2 FPS的分離純化 清水刷洗干海帶,除去泥沙,曬干,用微型植物式樣粉碎機(jī)粉碎成海帶顆粒。將 1 000 g海帶顆粒加入 10倍 95%乙醇,50℃,回流 0.5 h,以除去大部分色素、脂質(zhì)。濾渣揮干后,以 1∶40(g∶ml)加入 60℃水中回流 3 h,攪拌速度40 r/min,回流 2次。過(guò)濾,濾液中以 20 g/L加入 CaCl2粉末,反應(yīng)結(jié)束后,離心(4 000 r/min,15 min),收集上清液。減壓濃縮,加入 3倍體積 95%乙醇,4℃過(guò)夜,離心(6 000 r/min,20 min),沉淀用無(wú)水乙醇、丙酮各洗 1次,干燥,得 FPS粗糖〔3〕。將 FPS粗糖配制成 1%的糖溶液,用 0.22μm的中空纖維膜過(guò)濾,除去多糖溶液雜質(zhì),經(jīng) 7萬(wàn)～8萬(wàn)中空纖維膜截留,凍干,得純 FPS。

1.3 噻唑藍(lán)(MTT)法觀(guān)察 FPS對(duì) GMCs的增殖作用 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞,消化成細(xì)胞懸液,按 5×105/ml濃度轉(zhuǎn)種于96孔板,常規(guī)培養(yǎng) 24 h,換無(wú)血清培養(yǎng) 24 h,然后分為:正常對(duì)照組(10%FCS,含葡萄糖 5.4 mmol/L);高糖損傷組(10%FCS,含葡萄糖 30 mmol/L);Val(2×10-5、2×10-6、2×10-7mol/L)組;FPS高、中、低劑量 (500,50,5 μg/ml)組;其中用藥組均用高糖培養(yǎng)基培養(yǎng),每組設(shè) 6個(gè)復(fù)孔。分別培養(yǎng) 24、48、72h,加入 MTT溶液(5mg/L)酶標(biāo)儀上以 595nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔 OD570值。

1.4 ELISA法觀(guān)察 FPS對(duì)高糖刺激的 GMC培養(yǎng)液中 TGF-β1含量的影響 取細(xì)胞及分組方法同實(shí)驗(yàn) 1.3,按 5×105/ml濃度轉(zhuǎn)種于 24孔板,每組設(shè) 3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng) 48 h后取上清液,每孔設(shè) 2個(gè)復(fù)孔。按照 ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì) TGF-β1含量進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 免疫組化法觀(guān)察 FPS對(duì)高糖刺激的 GMC Col-Ⅳ表達(dá)的影響 玻片處理:8 mm×8 mm蓋玻片泡酸過(guò)夜,清水沖洗 20遍,無(wú)水乙醇中浸泡 6h后用超純水沖洗 3次,放入培養(yǎng)皿中烘干,高壓滅菌,烘干后放入超凈臺(tái)中備用。選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 GMCs細(xì)胞,胰酶消化制成細(xì)胞懸液;在 24孔板內(nèi)每孔滴加 1滴培養(yǎng)基,將處理過(guò)的玻片放入空內(nèi);以 3×105/ml濃度接入 24細(xì)胞。37℃培養(yǎng) 24h,使細(xì)胞達(dá)到 50% ～80%融合,換無(wú)血清低糖培養(yǎng)基培養(yǎng) 24h,使細(xì)胞統(tǒng)一于G0期,分組及培養(yǎng)條件同 1.3。48h棄去培養(yǎng)液,用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗 2次,每孔加入 2 ml 4%多聚甲醛 4℃固定 1～1.5 h。免疫組化染色操作按照 SABC試劑盒要求。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用 SPSS13.0軟件,計(jì)量資料以±s表示,進(jìn)行單樣本正態(tài)性、方差齊性檢驗(yàn)。運(yùn)用單因素方差分析及組間數(shù)據(jù) t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 FPS提取率 經(jīng) 7萬(wàn)～8萬(wàn)中空纖維膜得截留液,濃縮,冷凍干燥后的得率為 1.01%,平均分子量為 83萬(wàn)D。苯酚硫酸法測(cè)得糖含量為 67.03%,氯化鋇-明膠法測(cè)得硫酸根含量為38.29%。

2.2 FPS對(duì)高糖刺激的 GMC增殖的影響 高糖刺激 24 h即顯著促進(jìn)了系膜細(xì)胞增生,這種作用在刺激 48 h后達(dá)到了最強(qiáng),72h結(jié)果顯示高糖對(duì) GMCs的增殖作用轉(zhuǎn)為抑制。48 h結(jié)果顯示,在此濃度范圍內(nèi),各給藥組均顯著抑制 GMCs的增殖(P＜0.01,P＜0.05),且與劑量成正比。見(jiàn)表 1。

2.3 FPS對(duì)高糖刺激的 GMC培養(yǎng)液 TGF-β1含量的影響 高糖刺激 GMCs 48 h后,細(xì)胞分泌 TGF-β1明顯增多,藥物干預(yù)組均顯示出了對(duì)細(xì)胞分泌TGF-β1的抑制作用,與劑量正相關(guān)。其中 FPS的高、中劑量組抑制作用明顯優(yōu)于低劑量組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05,P＜0.01),與Val相應(yīng)對(duì)照組無(wú)明顯差異。見(jiàn)表 2。

2.4 FPS對(duì)高糖刺激的GMCs中Col-Ⅳ含量的影響 高糖刺激GMCs 48 h能夠使細(xì)胞分泌過(guò)多的Col-Ⅳ。正常組細(xì)胞的胞漿區(qū)幾乎沒(méi)有染色,高糖刺激組的細(xì)胞則可見(jiàn)明顯的黃染。給藥組均能夠抑制細(xì)胞分泌過(guò)多的 Col-Ⅳ(P＜0.01),其中 FPS高劑量組抑制細(xì)胞分泌 Col-Ⅳ作用最顯著(P＜0.05),效果與Val組相似。見(jiàn)表 2,圖 1。

圖1 FPS對(duì)高糖刺激的 GMCs Col-Ⅳ的影響(×400)

表1 FPS對(duì)高糖刺激的GMCs增殖的影響(±s,n=6)

表1 FPS對(duì)高糖刺激的GMCs增殖的影響(±s,n=6)

與正常組比較:1)P＜0.01;與高糖損傷組比較:2)P＜0.01

組別 24h 48 h 72 h正常組 0.500 8±0.038 0.615±0.091 0.8774±0.021高糖損傷 0.936 8±0.0261) 1.021±0.0171) 0.8664±0.014 FPS高劑量組 0.8035±0.0271)2)0.794 7±0.0312)0.694 8±0.02311)2)FPS中劑量組 0.882 8±0.0311) 0.888 4±0.011 0.8096±0.110 FPS低劑量組 0.903 3±0.0251) 0.935 7±0.014 0.8548±0.117 Val高劑量組 0.764 3±0.036 11)2)0.706 2±0.0362)0.679 1±0.0861)2)Val中劑量組 0.8056±0.037 11) 0.779 6±0.046 0.745 9±0.0331)Val低劑量組 0.8762±0.038 41) 0.856 3±0.049 0.7986±0.078

表2 FPS對(duì)高糖刺激的GMCs培養(yǎng)液中TGF-β 1、Col-Ⅳ的影響(±s,n=6)

表2 FPS對(duì)高糖刺激的GMCs培養(yǎng)液中TGF-β 1、Col-Ⅳ的影響(±s,n=6)

與正常組比較:1)P＜0.01,2)P＜0.05;與高糖損傷組比較:3)P＜0.05,4)P＜0.01

組別 TGF-β1(ng/L) Col-Ⅳ光密度值正常組 54.94±4.23 147.5±14.4高糖損傷組 93.66±5.441) 239.1±11.71)FPS高劑量組 74.13±2.991)4) 159.9±6.03)FPS中劑量組 79.29±7.351)3) 182.7±13.61)3)FPS低劑量組 88.12±6.781) 196.7±10.461)Val高劑量組 68.57±4.782)4) 157.4±12.83)Val中劑量組 75.31±4.281)3) 179.6±15.13)Val低劑量組 81.08±5.841)3) 189.9±13.41)3)

3 討 論

GMCs屬于腎臟血管周?chē)逃屑?xì)胞,是腎小球中功能最活躍的細(xì)胞,具有分泌細(xì)胞基質(zhì)、產(chǎn)生細(xì)胞因子、吞噬和清除大分子物質(zhì)及類(lèi)似平滑肌細(xì)胞收縮的功能,同時(shí)也是 TGF-β1、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)等各種細(xì)胞因子作用的主要靶細(xì)胞〔4〕。正常情況下體內(nèi)系膜細(xì)胞不增殖,但在高糖等多種因素作用下,系膜細(xì)胞可發(fā)生異常的增殖,同時(shí)伴有系膜基質(zhì)的增多,最終導(dǎo)致腎小球硬化。以往對(duì) DN腎細(xì)胞周期的研究認(rèn)為,在DN早期,高糖環(huán)境對(duì)GMCs的生長(zhǎng)具有雙向的調(diào)節(jié)作用:在培養(yǎng)早期(24～48 h),高糖能促進(jìn) GMCs增殖,即進(jìn)行有限性增生,完成一或兩輪有絲分裂;此后高糖對(duì) GMCs增殖起抑制作用,細(xì)胞發(fā)生肥大〔5〕。細(xì)胞增殖主要與高糖激活 GMCs,表達(dá)過(guò)多血小板衍化生長(zhǎng)因子 B(PDGF-B)及其受體 PDGFR-β有關(guān);而細(xì)胞肥大與 TGF-β1表達(dá)過(guò)量有關(guān)〔6〕。

本研究采用體外培養(yǎng)大鼠 GMCs細(xì)胞株,高糖刺激細(xì)胞制造細(xì)胞損傷模型。應(yīng)用 MTT法(該法可靈敏反映代謝活躍的細(xì)胞增生狀態(tài))檢測(cè)高糖刺激 GMCs的增殖,結(jié)果表明:高糖刺激 24、48h后 GMCs增殖明顯增強(qiáng),72 h組則表現(xiàn)出抑制作用,與文獻(xiàn)報(bào)道一致。FPS對(duì)高糖誘導(dǎo)的GMCs增殖具有顯著的抑制作用,并且在一定的范圍內(nèi)濃度越高,其抑制作用越強(qiáng),尤其FPS高劑量組則表現(xiàn)出優(yōu)于其他用藥組的抑制細(xì)胞增殖作用,表現(xiàn)出與 Val相似的抑制活性,而不同 FPS劑量組與對(duì)照組及模型組之間細(xì)胞存活率無(wú)明顯差異,提示應(yīng)用 FPS干預(yù)治療DN時(shí)不會(huì)對(duì)腎臟系膜細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用,對(duì)其臨床應(yīng)用的安全性提供了理論依據(jù)。

TGF-β1是目前認(rèn)為最重要的致纖維化因子,是腎小球硬化過(guò)程中的核心細(xì)胞因子〔7〕,不僅能夠刺激成纖維細(xì)胞的增殖還能抑制膠原酶和 Stromelysis酶的轉(zhuǎn)錄,增加金屬蛋白酶抑制物的合成,且參與腎間質(zhì)纖維化的各個(gè)細(xì)節(jié),對(duì)腎間質(zhì)中 ECM的沉積有著極重要的作用。本研究結(jié)果證實(shí),高血糖狀態(tài)下,流經(jīng)腎小球的血流動(dòng)力學(xué)發(fā)生改變,局部 AngⅡ濃度升高,誘導(dǎo)TGF-β1水平顯著升高;同時(shí)高血糖可以直接促進(jìn) TGF-β1的合成。高水平的 TGF-β1通過(guò)一系列作用進(jìn)一步促進(jìn)DN的發(fā)生發(fā)展,主要包括:①刺激腎小球細(xì)胞 ECM合成增加,用免疫組化法證實(shí) TGF-β1高的地方,ECM也明顯積聚,基底膜明顯增厚〔8〕;②刺激腎小球系膜細(xì)胞的增殖,由過(guò)碘酸-雪夫(PAS)染色結(jié)果可以判定細(xì)胞個(gè)數(shù)都大于 4個(gè)。③促進(jìn)肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化進(jìn)而合成及分泌間質(zhì)膠原〔9,10〕,Col-Ⅳ型膠原的免疫圖片證實(shí)基質(zhì)增厚的地方,染色陽(yáng)性也顯著增加。④過(guò)度表達(dá)的TGF-β1可以通過(guò) Smad蛋白(TGF-β1惟一受體的細(xì)胞內(nèi)激酶底物,介導(dǎo) TGF-β1胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo))途徑實(shí)現(xiàn)促進(jìn)細(xì)胞肥大〔11,12〕。Val作為 ARB的代表性藥物,能夠阻斷高糖誘導(dǎo)的腎素-血管緊張素-醛固醇(RAS)系統(tǒng)激活,通過(guò)抑制 AngⅡ發(fā)揮作用實(shí)現(xiàn)抑制 GMCs的增殖。

Co1-Ⅳ是構(gòu)成ECM的主要結(jié)構(gòu)蛋白之一,也是數(shù)量最多的一種〔13〕,它構(gòu)成了 ECM基本的網(wǎng)絡(luò)樣框架結(jié)構(gòu),并伴有其他系膜成分插入,形成了腎小球獨(dú)特的網(wǎng)狀微環(huán)境。DN時(shí)腎小球和腎小管ECM的Col-Ⅳ合成增加,而且腎小管的合成要早于腎小球。在層黏聯(lián)蛋白(LN)作用下,其介導(dǎo)多種細(xì)胞的黏附,與Col-Ⅳ等多種ECM成分共同維系其動(dòng)態(tài)平衡,DN時(shí)打亂平衡,在腎臟引起腎小球硬化及腎間質(zhì)纖維化〔14〕。本實(shí)驗(yàn)中 FPS對(duì)高糖刺激的 TGF-β1、Co1-Ⅳ分泌增多有顯著的抑制作用,其作用效果與濃度呈正相關(guān)。說(shuō)明 FPS能夠減少硬化核心因子TGF-β1的合成和分泌,延緩細(xì)胞基質(zhì)的積聚,推遲腎小球的硬化進(jìn)程,發(fā)揮對(duì)腎臟的保護(hù)作用。相關(guān)的作用機(jī)制可能與降低TGF-β1含量、抑制 GMCs分泌 TGF-β1、Col-Ⅳ,實(shí)現(xiàn)抑制 GMCs過(guò)度增殖有關(guān)。

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