非創傷性雙下肢缺血后處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用

顧迎春 于曉玲 郭維軍 (淮陰醫院心內科,江蘇 淮陰 223300)

缺血性心臟病是心血管疾病的多發病與常見病,目前保護缺血心肌最有效的方法是再灌注,即血管再通術。然而隨之帶來的再灌注心律失常、代謝異常以及心肌超微結構的改變,即心肌的缺血再灌注損傷,直接影響病人的預后。多年來研究人員為減輕缺血再灌注損傷先后進行了缺血預處理、缺氧預處理、藥物預處理等有效方法的研究,但因很難預測急性缺血事件的發生,預處理的臨床應用受到限制。 2003年 Zhao等〔1〕首先提出缺血后處理(IPTC,經典后處理)并證實其與預處理有類似的保護效果,但經典后處理是一個附加的缺血干預,操作復雜有創,臨床應用受限。而遠程后處理操作簡單易行,如能證實有效,臨床上應用前景將更為廣闊。本文旨在探討在體情況下,經典后處理及遠程缺血后處理對大鼠心肌缺血面積及超氧化物歧化酶(SOD)等的影響,為臨床尋找心肌缺血事件發生后的心肌保護方法提供基礎研究資料。

1 材料與方法

1.1 模型制作與分組 健康雄性 SD大鼠(遼寧醫學院實驗動物中心提供)40只,體重 250～300 g。大鼠用烏拉坦 1 g/kg麻醉,描記肢導心電圖,氣管插管,上呼吸機,分離左側頸總動脈留用;沿左鎖骨中線縱行切開皮膚,分別在 2、3、4肋間隙進針穿線,分開肋間隙和軟組織,剪斷肋骨,暴露心臟,以左冠狀動脈主干為標志,在左心耳下緣 2～3 mm處進針,5/0絲線穿過,用一長約 5mm,直徑 1.5 mm的乳膠管墊于血管與結扎線之間,打活結,以收緊結扎線時S-T段抬高。放松后S-T段下降1/2以上為模型成功,關閉胸腔。40只大鼠隨機分四組,每組10只。①假手術組(空白組):開胸后穿線,不收緊扎線;②再灌注損傷組(I/R組):收緊結扎線,造成缺血 30 min;③IPTC組(后處理組):打活結結扎 30 min,再通 10 s,結扎 10 s重復 4次;④非創傷性雙下肢缺血后處理組(遠程組),操作同IR組,在再灌注同時捆綁雙下肢 5 min,以不能觸及股動脈搏動為準,松開 5 min,反復 3次,以上各組剪斷結扎線后均再灌 180 min。

1.2 檢測指標及方法

1.2.1 心律失常評分 記錄缺血和再灌期間室早發生次數,室速、室顫發生率及累計持續時間。參照文獻〔1〕進行評分,0分:無室性心律失常或僅發生室早,且 ＜5次 /min;1分:僅發生室早≥5次/min;2分:僅發生一陣室速且 ＜60 s;3分:發生一陣≥60 s的室速或發生多陣室速但累計時間≤60 s;4分:發生多陣室速且累計時間≥60s;5分:發生室顫但能夠自動恢復;6分:出現不可恢復的室顫或在觀察期內死亡。

1.2.2 心肌梗死范圍測量 取血畢,原位結扎冠狀動脈,1%伊文思藍 2ml由主動脈逆行注入左心室,剔出心房和右室及藍染區域,-20℃冰凍 20 min,取出后將心臟橫切成 1～2 mm的短軸切片,放入 1%TTC 0.1 mmol/L磷酸緩沖液中(pH值7.4)中,37℃孵育 20 min。TTC染色后梗死心肌不染色,呈灰白色,缺血區心肌呈紅色,分離后濾紙吸干,稱重,梗死范圍以壞死心肌重量與左室重量(壞死+非壞死)之比表示。

1.2.3 光鏡下觀察大鼠心肌形態改變 實驗結束立即取下心臟,4%甲醛固定,從心尖始間距為 0.3cm橫向連續切片,石蠟包埋切片(5μm厚),HE染色,光鏡下觀察病理改變。

1.2.4 血清生化指標測定 于 180 min再灌注末,頸總動脈取血 4ml,1 500 r/min離心 10min,取上清液,測定血中磷酸肌酸激酶(CK)、SOD、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)及一氧化氮合酶(NOS)含量,各項均按試劑盒方法測定及計算。

1.3 統計學方法 全部數據分析采用SPSS11.5統計軟件進行分析,計量資料以±s表示,采用單因素方差分析。

2 結 果

2.1 心律失常評分比較 缺血期及再灌注期間后處理組、遠程組心律失常評分明顯高于空白組、I/R組,差異有顯著統計學意義(P＜0.01),見表 1。

2.2 心肌梗死范圍測量 空白組壞死區重量為 0 g;I/R組、后處理組、遠程組三組間左室重量相當;遠程組、后處理組梗死范圍明顯低于 I/R組(P＜0.01),見表 2。

2.3 光鏡下觀察大鼠心肌形態改變 空白組心肌纖維染色均勻、橫紋清晰,心肌間質未見出血壞死及炎性細胞浸潤;I/R組心肌組織有不同程度腫脹,心肌纖維斷裂,間質有較多炎性細胞浸潤,肌間質有瘀血;遠程組與后處理組心肌細胞腫脹明顯減輕,心肌纖維呈波浪狀,肌漿分布不均勻,心肌間質無出血,有少量炎性細胞浸潤,見圖 1。

表1 各組心律失常評分比較(n=10,±s,分)

表1 各組心律失常評分比較(n=10,±s,分)

與空白組比較:1)P＜0.01;與 I/R組比較:2)P＜0.01

組別 缺血期 再灌注期空白組 0.2±0.42 0.1±0.32 I/R組 1.2±1.031) 2.7±1.771)后處理組 1.1±0.881) 1.4±0.971)2)遠程組 1.0±0.661) 1.5±0.841)2)

2.4 血清生化指標測定 遠程組及后處理組 CK、MDA含量明顯低于 I/R組;SOD、NOS含量明顯高于 I/R組,見表 3。

表2 大鼠梗死范圍、左室重量的比較(n=8,±s)

表2 大鼠梗死范圍、左室重量的比較(n=8,±s)

與 I/R組比較:1)P＜0.01

組別 壞死區(g)非壞死區(g)梗死范圍(%)左室重量(g)I/R組 0.175 4±0.194 0.281 2±0.032 4 38.50±4.41 0.457 9±0.334后處理組 0.114 4±0.1011)0.354 8±0.2281) 22.59±1.751) 0.469 2±0.254遠程組 0.121 7±0.0771)0.316 4±0.023 91)27.78±1.971) 0.438 1±0.136

表3 各組大鼠血清生化指標的比較(n=10,±s)

表3 各組大鼠血清生化指標的比較(n=10,±s)

與空白組比較:1)P＜0.01;與 I/R組比較:2)P＜0.05,3)P＜0.01

組別 CK(U/L) SOD(U/ml) MDA(nmol/ml) NO(μmol/ml) NOS(nmol/ml)空白組 38.29±11.94 75.7±6.90 4.07±0.95 102.06±18.71 45.24±6.37 I/R組 183.99±32.911) 38.53±5.871) 10.86±1.881) 63.12±10.201) 28.88±4.561)后處理組 98.98±18.571)3) 60.17±6.331)3) 8.94±1.811)2) 76.96±13.331)2) 38.14±6.041)3)遠程組 121.36±21.541)3) 58.39±7.281)3) 9.38±2.291)2) 77.22±15.891)2) 35.91±7.631)3)

圖1 各組心肌組織病理學觀察(HE)

3 討 論

本研究利用止血帶所致的肢體缺血,進行非創傷性雙下肢缺血后處理(N-W IPTC)對大鼠心肌I/R進行觀察,結果提示,N-W IPTC組與IPTC組的實驗大鼠心肌梗死組織重量百分比比較無顯著性差異,而與I/R組比較,IPTC組和N-WIPTC組的大鼠心肌梗死組織重量百分比顯著減小,表明和 IPTC的心肌保護作用一樣,N-WIPTC也具有減少大鼠I/R心肌梗死面積的作用,推測其可能機制有:①反復捆綁和松開下肢,可刺激兒茶酚胺釋放增加,與受體結合后激活 G蛋白和磷脂酶 C,隨之活化蛋白激酶 C(PKC),上調熱休克蛋白的轉錄而顯示保護效應〔2〕,②下肢捆綁后導致局部缺血缺氧,刺激血管內皮細胞內 Ca2+濃度增加,使 NO合成酶活化,產生并釋放 NO,NO可通過 cGMP含量增加而減少Ca2+內流或抑制心肌細胞內 Ca2+釋放而發揮心肌保護作用,③下肢 I/R后處理過程中,局部缺血缺氧產生的氧自由基,產生與后處理相似作用,氧自由基在介導 IPTC心肌保護起著重要作用〔3,4〕。

上述研究表明,在體大鼠 N-W IPTC能夠明顯縮小心肌梗死面積,即遠程缺血后處理同經典 IPTC一樣對I/R心肌具有保護作用,其機制可能與減輕氧自由基損傷,抑制鈣超載、保護血管內皮、減輕微血管損傷和炎癥反應等作用有關〔5〕,但其保護心肌的確切機制尚有待進一步研究。

1 Zhao ZQ,Corvera JS,Halkos ME,et al.Inhibition of myocardial injury by ischernic postconditioning during reperfusion;comparision with ischernic preconditioning〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol,2003;285(2):579-88.

2 袁志柳,王藝明,沈 正,等 .非創傷性雙下肢缺血后處理對大鼠 I/R心肌梗死面積和 PKCa表達的影響〔J〕.貴陽醫學院學報,2006;31(3):238-40.

3 Pain T,Yang XM,Critz SD,et al.Opening of mitochondrial K(ATP)channels triggers the preconditioned state by generating free radicals〔J〕.Circ Res,2000;87(6):460-6.

4 Nakano A,Liu GS,Heusch G,et al.Exogenous nitric oxide can trigger a preconditioned statethrough a free radical mechanism,but endogenous nitric oxide is not a trigger of classical ischemic preconditioning〔J〕.J Mol Cell Cardiol,2000;32(3):1159-67.

5 Tessier-Vetzel D,Tissier R,Waintraub X,et al.Isoflurane inhaled at the onset of reperfusion potentiates the cardioprotective effect of ischemic postconditioning through a NO-dependent mechanism〔J〕.J Cardiovasc Pharmacol,2006;47(3):487-92.