高濃度氧對豬肺動脈內皮細胞鈣離子濃度的影響

黃文峰 廖貴華 (三峽大學醫學院,湖北 宜昌 443002)

以靜脈途徑給予高氧液是比較理想的氧療方式,但仍有可能引起氧中毒,損傷細胞對象不確定且機制不明〔1〕。血管內皮與臨床疾病密切相關,既是心血管疾病的病變基礎,又是影響血管內皮相關疾病如腫瘤、感染進程的重要因素。內皮細胞能感受血流壓力變化、炎性信號及血液循環中激素水平的變化,并通過胞內一系列信號分子如鈣離子,調節血管舒縮狀態,維持血管內外平衡〔2〕。與低氧刺激不同,關于高氧刺激對機體細胞內鈣離子濃度影響的報道不多,Corinna通過原位觀察發現〔3〕,離體大鼠肺在高氧刺激下,血管內皮細胞鈣離子濃度可以升高。本實驗首次以原代培養的豬肺動脈內皮細胞為研究對象,通過模擬高氧氣體的刺激觀察鈣離子的變化情況。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 M199細胞培養基(Gibco,美國),小牛血清(Hycolone,美國),胰蛋白酶(Amresco,美國),Fura-2(Sigma,美國),雙波長熒光分光光度計(850型,日本島津公司)。

1.2 原代培養豬肺動脈內皮細胞 成年雜種豬,放血處死后取出心肺,無菌條件下剪開心包膜,分離肺動脈主干及其分支。用止血鉗夾住兩端,松開肺動脈主干端,用 D-Hank′s液灌洗肺動脈內腔直至洗出液清亮為止,加入 37℃預溫的 0.25%的胰蛋白酶溶液 2～3ml,開始計時,夾閉管口,置 37℃溫箱中孵育5～6 min。吸出消化液入一試管中,用含 10%小牛血清的M199培養基中和,用 M199培養基反復灌洗肺動脈腔,收集灌洗液,連同消化液一起以 1 000 r/min離心 10min,棄上清,沉淀用含 10%胎牛血清的 M199培養基重懸,吹打成細胞懸液。5～7 d后,細胞長滿培養面,倒置顯微鏡下可見細胞呈鵝卵石樣單層貼壁生長。用 0.25%胰蛋白酶按 1∶2傳代培養。第 2～3代的細胞用于實驗。

1.3 高濃度氧刺激方法及實驗分組 流量為 5 L/min的高氧氣體(5%CO2和 95%O2)在細胞培養瓶中平衡 2～5 min左右,使氧分壓達到 250 mmHg和 550mmHg左右,然后瓶口被密閉,于 CO2培養箱中繼續培養 0.5、1、2、4 h,然后分別測定鈣離子濃度。

1.4 細胞內鈣離子濃度的測定 測定前先用 0.125%胰蛋白酶消化大約 1 min,用適量的生長培養液終止胰酶的消化反應,并制備成濃度為 105個/ml的細胞懸液。取細胞懸液 1 ml,加入 0.5 mmol/L的Fura-2/乙酰酸甲酯(AM)(Sigma,USA)的二甲基亞砜(DMSO)貯備液 4μl(終濃度 2μmol/L)負載。置37℃、5%CO2培養箱孵育 40 min后,1 500 r/min離心 5 min,小心吸出上述負載液,避免細胞團塊倒出。然后用含 0.2%牛血清白蛋白的 D-Hanks液洗滌細胞 2次,每次洗滌均以1 500 r/min離心后小心吸出液體,防止細胞丟失。最終用 3 ml含鈣離子 D-Hanks測定液〔mmol/L:NaCl 140.000;KCl 4.765;CaCl215.652;葡萄糖(Glucose)53.763;3-環乙氨基丙磺酸(HEPES)5.000;pH7.0～7.2〕懸起細胞。雙波長熒光分光光度計測定鈣離子的條件為狹縫寬度 10 nm,以 340 nm和 380 nm波長激發,500 nm波長發射,根據下式計算細胞內游離鈣含量:

Kd=224 nmol/L;R=F340/F380;Rmax為 Fura-2飽和時產生的最大熒光比值,以 1%Triton X-100(1 ml細胞懸液加 10%Triton X-100 100μl)測定;R min為 Fura-2游離時形成的最小熒光比值,以 50 mmol/L EGTA〔1 ml細胞懸液加 500 mmol/L乙二醇雙四乙酸(EGTA)100μl〕測定。每個波長各測定 2次熒光值(F),取其平均值。FD、FS分別代表 Ca2+為零和飽和狀態下,在 380 nm波長測得的熒光值。

1.5 統計學分析 用 SPSS13.0統計軟件進行分析,數據以±s表示,多組間樣本均數的比較用 F檢驗。

2 結 果

2.1 高氧對豬肺動脈內皮細胞生長的影響 經高氧刺激后,豬肺動脈內皮細胞在形態上出現折光性減弱、細胞皺縮等生長不良的特征,培養基的p H值變化不明顯。

2.2 高氧對豬肺動脈內皮細胞胞內鈣離子濃度的影響 當培養液氧分壓達到 250 mmHg時,與常氧對照組相比,鈣離子濃度開始變化并不明顯,在1h時可以觀察到明顯升高(P＜0.05);當培養液氧分壓達到 550mmHg時,與常氧對照組相比,鈣離子濃度在 0.5h時可以觀察到增高(P＜0.05),1h時升高更為顯著;對于相同刺激時間點,氧分壓越高,鈣離子濃度也越高。見表 1。

表1 高氧對豬肺動脈內皮細胞胞內鈣離子濃度的影響(±s,n=5,μmol/L)

表1 高氧對豬肺動脈內皮細胞胞內鈣離子濃度的影響(±s,n=5,μmol/L)

與常氧對照組比較:1)P＜0.05

培養液氧分壓 常氧對照組 0 h 0.5 h 1 h 250 mmHg組 110.85±32.33 107.15±55.16 113.62±26.35 125.23±31.381)550 mmHg組 110.85±32.33 116.76±33.58 126.81±10.691) 137.37±29.621)

3 討 論

血管內皮細胞是血流和血管壁組織之間的物理屏障,對維持血流狀態、血管內外物質交換起重要作用;血管內皮細胞具有活躍的內分泌功能,在創傷修復、血管生成、血栓形成、血壓穩定等方面發揮著重要的調節功能。由于血管內皮細胞和血液直接接觸,容易受到血液中各種因素的影響,導致內皮細胞功能障礙,從而成為許多疾病發生的重要環節〔2〕。

氧療對于心腦血管疾病有著較好的輔助治療作用,可以提高動脈血氧分壓和動脈血氧飽和度,增加動脈血氧含量,糾正各種原因造成的缺氧狀態,促進組織新陳代謝。靜脈給氧技術是非常有希望的氧療方法,能有效的治療各種缺血缺氧性疾病,且相對安全,不良反應少〔4〕。鈣離子是機體的必需元素,也是機體的第二信使,廣泛參與細胞內多條途徑的信號傳遞,從而影響細胞的多種生理活動,對維持細胞各種代謝過程非常重要〔5〕。有關高氧時對細胞信號轉導系統影響的報道很少,使得人們對于在高氧條件下如何進一步增強細胞利用氧的能力和防止氧中毒等帶來認識上的不足。已知高氧刺激細胞時,活性氧生成增多,其他信號分子如核轉錄因子(NF-κB),一氧化氮(NO)也會發生相應變化〔6〕,但鈣離子的變化情況尚不清楚。Corinna模擬機械通氣的方法,原位觀察離體大鼠肺內皮細胞相關信號分子的變化,發現活性氧和鈣離子在高氧時均增高〔3〕。也有學者研究肺泡巨噬細胞發現,經高氧刺激后鈣離子升高,可能與其吞噬功能變化有關〔7〕。

本研究結果表明,原代培養的豬肺動脈內皮細胞在不同氧分壓的高氧刺激下可以導致胞內鈣離子升高,當氧分壓不太高時,鈣離子濃度并不立即升高,表明內皮細胞對高氧有一定的耐受性;隨著氧分壓的增高,鈣離子濃度也相應升高;相同時間點比較,氧分壓引起鈣離子濃度升高的效應也很明顯。氧分壓引起豬肺動脈內皮細胞鈣離子濃度升高的機制可能與細胞自我保護有關,引起內質網和線粒體釋放鈣離子。

1 潘 麗,富建華,薛辛東.氧化/抗氧化失衡與高氧肺損傷〔J〕.中國當代兒科雜志,2009;11(3):237-9.

2 陶 軍.高血壓與血管內皮功能〔J〕.中國實用內科雜志,2009;29(9):783-6.

3 Brueckl C,Kaestle S,Kerem A,et al.Hyperoxia-induced reactive oxygen species formation in pulmonary capillary endothelial cells in situ〔J〕.Am J Respir Cell Mol Biol,2006;34(4):453-63.

4 曹俊華,李健和,彭六保,等.高滲高氧靜脈制劑的應用機制〔J〕.中國新藥與臨床雜志,2009;28(8):566-70.

5 丁 燁,王 楓 .膳食鈣對高血壓的降壓機制研究進展〔J〕.國外醫學.衛生學分冊,2006;33(6):369-72.

6 Thom SR,Bhopale V,Fisher D,et al.Stimulation of nitric oxide synthase in cerebral cortex due to elevated partial pressures of oxygen:an oxidative stressresponse〔J〕.J Neurobiol,2002;51(2):85-100.

7 Wesselius LJ,Williams WL,Bailey K,et al.Iron uptake promotes hyperoxic injury to alveolar macrophages〔J〕.Am J Respir Crit Care Med,1999;159(1):100-6.