EGb761對慢性腦缺血老齡大鼠學習能力及腦少突膠質細胞表達的影響

王金蘭 仲玉潔 (鄭州大學第二附屬醫院神經內科,河南 鄭州 45004)

中樞神經系統髓鞘由少突膠質細胞(OLG)形成〔1〕,髓鞘是神經信號跳躍式傳導的物質基礎。研究發現慢性腦缺血容易導致腦白質脫髓鞘,且這種變化與少突膠質細胞損害密切相關〔2,3〕。髓鞘脫失,神經傳導受到嚴重影響,導致機體學習認知功能障礙。標準銀杏葉提取物(EGb761,Ginkgo biloba extract 761)在治療學習認知功能障礙方面得到了肯定,但其相關作用機制的研究相對較 少。 2′3′-環核 苷酸 3′-磷 酸二酯酶(2′3′-cyclic nucleotide3′-Phosphode-esterase,CNPase)是一 種髓鞘標志酶,而且在 OLG中含有高水平 CNPase。本試驗通過對慢性腦缺血大鼠模型給予 EGb761進行干預,應用 CNPase抗體標記成熟OLG并觀察其表達情況,探討EGb761對老齡大鼠學習能力及腦OLG的影響,為其在認知功能治療機制方面開辟新思路、提供實驗證據。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 30只雄性 12月齡 SD大鼠,體重(400±30)g,由鄭州科大學醫學院實驗動物中心提供。隨機分成三組:假手術組,單純缺血組,EGb761干預組,每組 10只。

1.2 主要試劑與儀器 EGb761(達納康,按國際標準銀杏葉提取物要求選取,內含 24%的銀杏黃酮苷和 6%的萜烯內酯),40 mg/粒,由法國博福-益普生制藥工業公司生產;MG-2C/3C迷宮刺激器,由張家港市生物醫學儀器廠生產;CNPase抗體(2′3′-環核苷酸 3′-磷酸二酯酶抗體),購自北京博奧森生物技術有限公司。

1.3 慢性腦缺血模型鼠的制作 參考 Wakita等〔4〕方法制備動物模型。10%水合氯醛(0.3 mg/100 g)腹腔內注射麻醉后,頸部備皮、消毒,頸正中切開皮膚,切口約 1.5～2.0 cm,鈍性分離筋膜、胸骨舌骨肌,分離出雙側頸總動脈,每側用雙線分別在近心端和遠心端結扎,然后在兩結扎處之間剪斷頸總動脈制備出單純缺血組和干預組模型,假手術組僅分離雙側頸總動脈而不結扎,縫合切口,對皮并消毒,放回原環境中飼養。

1.4 給藥方法 將達納康研成粉末狀,用蒸餾水溶解并混勻,術后 24h按照 0.5 ml/100g予灌胃,單純缺血組給予等量蒸餾水灌胃,各組灌胃均為每日一次,持續 12 w。

1.5 學習能力測試 大鼠的學習能力測試在呈三等分輻射狀的 Y迷宮中進行,環境為安靜暗室。Y迷宮每臂頂端各裝一盞15 w的刺激信號燈,相應臂的信號燈亮時,該臂不通電為安全區,另外無燈光的兩臂及交界區均通以 50～70 V交流電而成為電擊區。實驗開始時,讓大鼠在起步區(大鼠開始所在的臂)適應 5 min,然后無規則次序變換安全區,觀察動物學會逃離電擊區而進入安全區的反應能力。規定大鼠在受電擊后10s內一次性跑向安全區為正確反應。實驗中每次通電刺激的間隔時間為 30s。以大鼠連續訓練 10次中出現 9次以上正確反應作為學會的標準,以達到學會標準所需總電擊次數表示學習成績。

1.6 標本的收集與處理 大鼠經麻醉后,常規生理鹽水及多聚甲醛灌注、固定,斷頭取腦,制作腦部冠狀石蠟切片(厚度4μm),采用免疫組化染色,檢測腦皮層、胼胝體及海馬 CNPase陽性細胞數的情況。

1.7 統計學處理 應用SPSS16.0統計軟件進行分析,應用獨立樣本 t檢驗。

2 結 果

2.1 大鼠學習成績測試結果 大鼠學習成績測試結果顯示,假手術組大鼠反應良好,學習成績為(33.3±1.16);而單純缺血組大鼠表現反應遲鈍,達標所需訓練次數明顯增多,成績為(68.3±2.06),與假手術組相比差異顯著(P＜0.01);EGb761干預組的學習成績(46.9±1.45)明顯好于單純缺血組,差異具有統計學意義(P＜0.01)。

2.2 大鼠腦 OLG CNPase的變化情況 各組均取皮層、胼胝體、海馬處進行觀察并統計 CNPase陽性細胞個數。單純缺血組 CNPase陽性細胞數明顯少于假手術組和 EGb761組,差異均具有統計學意義(P＜0.05)。見表 1。

表1 大鼠皮層、胼胝體、海馬 CNPase陽性細胞表達情況(±s,n=10,個/400倍高倍鏡視野)

表1 大鼠皮層、胼胝體、海馬 CNPase陽性細胞表達情況(±s,n=10,個/400倍高倍鏡視野)

與假手術組比較:1)P＜0.01;與單純缺血組比較:2)P＜0.01

組別 皮層 胼胝體 海馬假手術組 9.7±1.34 27.8±1.93 7.7±0.95單純缺血組 4.8±1.031) 18.2±1.751) 3.9±0.881)干預組 7.1±1.12) 23.8±1.322) 5.7±0.822)

3 討 論

既往人們認為腦白質對缺血具有很高的耐受性,這一觀點影響著對缺血后膠質細胞改變及機制的研究,近年發現 OLG對缺血高度敏感〔5～7〕,影像學研究顯示老年人腦白質改變非常常見,認為與血管病變導致的慢性、持續性缺血有關,而當慢性腦缺血時 OLG較神經元更易受損。此外,與神經元不同,膠質細胞損害后具有較強的再生能力,已經發現在室管膜周圍存在OLG前體細胞,在一定條件下它可以增殖、分化并遷移至損傷區域〔5〕,起修復的作用。所以,以白質損害為主的病變具有較好的恢復潛力和更高的治療價值,保護 OLG損害也對預防老年性白質改變及相關的認知功能降低具有重要價值〔2〕。

本文提示慢性腦缺血可造成學習認知能力障礙。采用免疫組化 CNPase標記OLG的方法觀察大鼠腦組織中 OLG的表達情況,結果顯示,單純缺血組大鼠皮層、胼胝體、海馬內的CNPase表達較假手術組顯著減少,提示OLG存在缺血易損性。

國際標準 EGb761,含 24%的銀杏黃酮苷和 6%的萜烯內酯等多種活性物質,其藥理作用較廣泛,可協同作用于有關氧化應激、血液循環、神經遞質和炎癥反應等不同的病理過程,是針對提高人的認知功能應用最廣泛的草藥制劑,在歐洲尤其盛行,德國官方批準EGb761用于治療阿爾茲海默氏癥。本實驗結果顯示,EGb761提高模型大鼠定向學習記憶能力,其可能機制是通過抑制 OLG對缺血性損傷高度敏感的相關機制,包括氧化應激、興奮性氨基酸和凋亡通路激活等〔7〕,減輕 OLG在慢性腦缺血時的損傷、促進其再生及修復,減少髓鞘的脫失,從而改善神經信號傳導,改善學習認知功能障礙。

1 王新德,魏崗之.神經病學:神經系統脫髓鞘性疾病〔M〕.北京:人民軍醫出版社,2003:1-238.

2 李昕華,徐忠信,王曉明,等.慢性腦缺血致認知功能障礙大鼠神經細胞 Caspase-3表達及 GDNF給藥的影響〔J〕.中國生物制品學雜志,2008;21(3):224-6.

3 Onteniente B,Rasika S,Benchoua A,et al.Molecular pathways in cerebral ischemia:cues to novel therapeutic strategies〔J〕.Mol Neurobiol,2003;27(1):33-72.

4 Wakita H,Tominoto H,Akigauthi I,et al.Glia activation and white matter changes in the rat brain induced by chronic cerebral hypoperfusion:an immunohistochemical study〔J〕.Acta Neuropathol,1994;87(5):484-92.

5 王麗娟,徐 超.定量評估大鼠局灶性腦缺血再灌注后少突膠質細胞的病理學變化〔J〕.臨床神經病學雜志,2010;23(1):28-30.

6 楊 晶,鄧 方,喬 松,等.慢性腦缺血對大鼠神經行為學和腦白質病理學變化的影響〔J〕.中國腦血管病雜志,2009;6(12):646-50.

7 Dewar D,Underhill SM,Goldberg MP.Oligodendrocytes and ischemic brain injury〔J〕.J Cereb Blood Flow Metab,2003;23(3):263-74.