半胱氨酸蛋白酶-8在大鼠小腸缺血再灌注后 TNF-α誘導肺損傷中的作用

陳玉強 房學東 王躍生 孟凡石 (吉林大學第二醫院,吉林 長春 3004)

缺血再灌注(I/R)損傷是在缺血的基礎上恢復血流后,組織器官的損傷反而加重的現象,是外科常見的一種損傷。由于小腸為體內最大的細菌庫和淋巴庫,小腸I/R除了會引起局部組織的損傷外,更會由于細菌和毒素的釋放,移位到體循環而引起網狀內皮系統發生系列反應,發生急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)和多器官功能障礙綜合征(MODS),是患者死亡的主要原因之一〔1〕。但是,細胞炎性介質釋放的增加和細胞凋亡的產生以及臟器損害的發生機制,至今為止還不清楚。本文擬通過探討腫瘤壞死因子-α(TNF-α)誘導細胞凋亡的同時以及半胱氨酸蛋白酶-8(caspase-8)表達的研究,對小腸缺血所引起的遠隔臟器損害的發生機制進行分析,探尋一種全新的預防和治療腸系膜血管缺血性疾病導致ARDS和MODS的方法。

1 材料與方法

1.1 材料 Caspase-8(1∶100)購自上海滬尚生物科技有限公司;TNF-α購自武漢博士德生物工程有限公司;Ultra SensitiveTM S-P超敏試劑盒(鼠/兔)和 DAB顯色試劑盒購自福州邁新生物技術開發有限公司。

1.2 方法 健康雄性 Wistar大鼠 48只,清潔級,2～3月齡,體重 200～250 g,吉林大學實驗動物中心提供。隨機分為正常組、假手術組、對照組和實驗組。10%水合氯醛腹腔注射(0.25 ml/100 g體重),麻醉滿意后,取仰臥位固定。腹部常規消毒后無菌條件下取腹正中切口約 3～4 cm入腹,將腸管推向左側,游離腸系膜上動脈,以無創傷動脈夾夾閉腸系膜上動脈起始部,縫合切口〔2〕。60min后經原切口進腹,取出動脈夾,恢復血供。再灌注結束后,實驗組動物給予腹腔注射 TNF-α(1.5 mg/100 g體重),對照組不給予腹腔注射 TNF-α,假手術組不予阻斷腸系膜上動脈。24 h后,所有大鼠脫頸處死,剪開胸腔,充分暴露肺臟,左肺進行灌注固定,右肺立即取部分肺組織稱濕重(W)并記錄,而后置于 80℃烘箱烘干 48 h至恒重,稱干重(D),求得濕干比值(W/D)。左肺置于 10%甲醛中 4℃下固定 24 h后,酒精梯度脫水、二甲苯透明,石蠟包埋,切片,厚度2μm。采用鏈霉素菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法(SP)免疫組織化學染色,按試劑盒操作說明進行,DAB顯色,蘇木素復染。在低倍鏡(40倍)下選取陽性表達密集區,在高倍鏡(400倍)下觀察細胞形態、染色定位和程度。每組選取 6張切片,每張切片隨機選取 5個不同重疊視野,輸入計算機分析累積光密度值。

2 結 果

2.1 肺組織 W/D值的變化 實驗組肺組織的 W/D值(6.58±0.05)顯著高于正常組(3.18±0.03)、假手術組(3.21±0.02)和對照組(4.25±0.04)(均 P＜0.05);對照組肺組織 W/D較假手術組和正常組明顯升高(P＜0.05)。

圖1 各組大鼠肺組織中 caspase-8免疫組織化學染色(×400)

2.2 肺組織 caspase-8的檢測 與對照組比較,實驗組caspase-8表達增強,主要分布在肺泡上皮細胞的胞漿,棕黃色,細顆粒狀,見圖 1。實驗組 caspase-8累積光密度值(2 048.01±118.33)較對照組(1 201.08±85.34)差異顯著(P＜0.05);對照組較假手術組(451.21±57.63)和正常組(416.32±71.69)明顯升高(P＜0.05)。

3 討 論

小腸 I/R后的病理生理機制尚不清楚,學者們先后提出了一系列學說。由于毒素及各種細胞因子的釋放,通過血液循環,遠隔臟器受到損害,其中增加的 TNF-α是導致肺臟損害的主要因子之一,并且可以誘導肺上皮細胞的凋亡〔3〕。急性肺炎癥反應與細胞因子表達和導致細胞凋亡的信號級聯放大系統有關。這個級聯放大系統是通過 TNF-α激活的,TNF-α是調節必要生物學功能的細胞因子家族典型成員,對于外界壓力和刺激具有反應〔4〕。它最初是通過免疫細胞,如單核和巨噬細胞釋放的,其他類型的細胞,包括腺泡細胞也能釋放。TNF-α與兩種細胞膜受體結合,即 TNF-α受體 1(TNFR1)和 TNF-α受體 2(TNFR2)。盡管多數細胞系和組織均表達兩種亞型,TNF-α的生物學活性主要通過 TNFR1調節。

靶細胞暴露到 TNF-α后,可能通過關閉自身受體下調它們對于細胞因子的反應。為了結合循環中過量的 TNF-α,就要釋放可溶性的抗體,因此兩種可溶性受體(TNFR1和 TNFR2)比TNF-α具有更長的半衰期,它們的濃度能夠反應 TNF-α的活性〔5〕。TNF-α在炎癥過程中的始發作用已經通過幾個細胞系、動物模型和人體實驗得到驗證〔6～8〕。在炎癥反應中,過量的TNF-α在炎癥基因誘導、細胞死亡、內皮細胞的增加、免疫細胞的聚集和活化過程中具有關鍵作用〔9〕。

肺組織 W/D是目前常用的評價肺水腫和反映微血管損傷的指標,肺組織損傷后,微血管內皮細胞和肺泡上皮細胞間隙增大,導致肺泡腔內大量炎性物質滲出、集聚、出血及炎性細胞游走。因此,肺損傷后 W/D升高,而實驗組 W/D值顯著高于正常組、假手術組和對照組,證明實驗組大鼠肺損傷較重。

在凋亡的信號通路中,caspase-8作為凋亡受體誘導的第一個放大信號,在細胞凋亡過程中受到廣泛研究。Caspase-8是包含 480個氨基酸分子量為 55 kD的蛋白,在它的N端前結構域包括 2個死亡效應域(DED),在它的C端是一個蛋白酶催化劑結構域。DED結構的功能為蛋白之間相互作用提供平臺〔10〕。在蛋白水解反應中,活化的caspase-8分子是由 2個大的和 2個小的亞基構成的四聚體〔11〕。在失活狀態下,在大多數細胞中caspase-8是作為最開始半胱氨酸蛋白酶的酶原形式出現。凋亡發生后,通過激活的死亡受體,caspase-8通過聚合成聚合體成為活化狀態〔12〕。

在哺乳動物細胞中,主要存在兩種細胞凋亡途徑,即細胞外(受體)途徑和細胞內(線粒體)途徑〔13〕。無論是細胞外還是細胞內途徑的刺激都能導致半胱氨酸蛋白酶活化。半胱氨酸蛋白酶在進化過程中是高度保守的家族,是細胞死亡各種形式常見的有效分子。一旦活化以后,它們切割胞漿或者胞核中的各種底物,導致細胞凋亡〔11〕。在細胞外凋亡途徑中,TNF死亡受體的刺激導致 caspase-8活化,隨后直接切割下游有效半胱氨酸蛋白酶,如 caspase-3〔14〕。同時,活化的 caspase-8可能通過切割 Bid,連接受體到線粒體途徑。而 Bid是 Bcl-2家族蛋白,在切割后能產生 BH 3結構域定位到線粒體,通過線粒體放大系統擴大〔15〕。在線粒體途徑中,各種凋亡因子的釋放最終激活了 caspase-3〔16〕。而 caspase-3是該途徑的最后值行者,具有“殺手蛋白”之稱。

本研究表明 caspase-8活化后參與到小腸 I/R后 TNF-α誘導的肺損傷中,是TNF-α細胞信號通路中的重要一部分組成。抑制其表達活性,可能減輕腸系膜血管缺血性疾病導致的ARDS和 MODS。

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