組胺對老齡大鼠腸道細菌易位的影響

楊書良 郝玉栓 李校天 李蘭梅 (河北工程大學醫學院,河北 邯鄲 056029)

生理情況下,腸道通過諸多屏障機制有效地防止腸道細菌及其毒素越過腸黏膜屏障,侵入肝、腎和腸系膜淋巴結等器官〔1〕。但在腸道感染時,腸黏膜屏障可受到損傷,引起腸道細菌易位〔2〕。 Walser等〔3〕報道,組胺受體阻斷劑可降低腸黏膜屏障的保護作用,增加腸道細菌易位的發生。本實驗旨在通過小劑量、低濃度組胺腸道內灌注,對腸道感染大鼠腸道細菌易位的影響來探索組胺對腸黏膜屏障是否有保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料 24月齡雄性 SD大鼠 30只,體重 260～270 g,購于河北醫科大學實驗動物中心,實驗前進行適應性飼養 48 h,均未發現異常。組胺為 Sigma-Aldrich公司產品。大腸桿菌 O75購于上海 Harmony公司。

1 .2 方法

1.2.1 實驗前準備 實驗前 24 h取大腸桿菌 O75單菌落放入 20ml肉湯培養液中培養,24 h后離心 15 min(5 000 r/min)去上清,加生理鹽水 10 ml,再離心去上清,重復 3次后,再加生理鹽水 10ml,取其中 1ml菌液在分光光度計(波長 600 nm)監測下,加生理鹽水稀釋至吸光度為 0.4止,此時菌液的大腸桿菌濃度為 3×1011/L。組胺配制成 100 ng/ml濃度,遮光低溫保存備用;戊巴比妥鈉用蒸餾水配置成 1%濃度備用。

1.2.2 動物模型制備 30只大鼠稱重、編號后,隨機分為對照組、腸道感染組和腸道感染+組胺組,每組 10只。所有大鼠實驗前 12h禁食,采用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(40 mg/kg),上腹部正中切口,在空腸上端插管接微泵。除對照組外,其他大鼠均從空腸上端灌注濃度 3×1011/L大腸桿菌液 0.4ml。菌液灌注后腸道感染 +組胺組大鼠立即用微泵向小腸內灌注100ng/ml組胺,灌注速度第 1小時 2 ml,以后 1.5 ml/h,灌注4 h,對照組和腸道感染組用同樣方法向小腸內灌注等量的生理鹽水,4 h后處死全部大鼠。以上操作均在無菌條件下進行。

1.2.3 細菌培養 在無菌條件下分別取出肝、腎和腸系膜淋巴結,稱重后添加 10倍量生理鹽水研磨成勻漿,各取 0.2ml勻漿均勻涂于普通營養瓊脂培養基上放入 37℃溫箱內培養,24 h后計算菌落數,并換算成每克組織含菌量(×105cfu/g)。每份標本均做兩份培養。

2 結 果

對照組10只大鼠中,有 3只大鼠肝勻漿培養基有細菌生長、2只大鼠腎勻漿培養基有細菌生長,1只大鼠腸系膜淋巴結勻漿培養基有細菌生長;腸道感染組全部大鼠肝、腎和腸系膜淋巴結勻漿培養基均有細菌生長;對照組與腸道感染組各組織間含菌量兩兩比較,均呈顯著性差異(P＜0.01),表明腸道感染大鼠模型可靠。腸道感染 +組胺組 10只大鼠中,有 10只大鼠肝勻漿培養基有細菌生長、7只大鼠腎勻漿培養基有細菌生長,5只大鼠腸系膜淋巴結勻漿培養基有細菌生長;與對照組和腸道感染組比較差異有統計學意義(P＜0.01,P＜0.05)。見表 1。

表1 各組大鼠各組織細菌培養平均含菌量(×105 cfu/g,±s)

表1 各組大鼠各組織細菌培養平均含菌量(×105 cfu/g,±s)

與腸道感染組比較:1)P＜0.01,2)P＜0.05

組別 n 肝 腎 腸系膜淋巴結正常對照組 10 1.02±0.431)0.62±0.301)0.38±0.251)腸道感染組 10 8.35±3.27 7.16±3.18 5.68±2.86腸道感染 +組胺組 10 5.25±2.082)4.06±2.022)3.58±1.862)

3 討 論

腸黏膜屏障是機體抵御外來病原微生物入侵的第一道防線。生理情況下,腸道通過腸黏膜上皮細胞及周圍緊密連接構成的上皮屏障;黏膜表面的黏液及不移動水層構成的黏液屏障;正常微生物群構成的生物屏障;腸黏膜免疫系統中各種免疫細胞以及它們所產生的免疫球蛋白、淋巴因子構成的免疫屏障;腸腔內胃酸、膽汁及各種消化酶、激素等構成的化學屏障來維持腸黏膜屏障的功能完整,以有效地防止病原微生物及毒素通過腸黏膜侵入機體〔1〕。但是,在嚴重創傷、全身及腸道嚴重感染、缺血及缺血-再灌注、營養障礙及全胃腸外營養、腸道內微生態失調、休克等情況下,可引起腸黏膜屏障損傷。腸道內原籍菌或外來菌以及它們的毒素就可突破腸黏膜屏障引起細菌易位〔4〕。正常情況下,腸道細菌也可通過門靜脈到達肝、腸淋巴系統到腸系膜淋巴結,但很少有腸道細菌通過血液循環到達腎。陳吉等〔5〕報道腸系膜淋巴結有 5%～10%的概率可以檢測到腸道細菌,這種自發性細菌易位,可能是機體全身免疫應答反應調節過程中的一種重要刺激源。楊書良等〔6〕報道 10月齡正常大鼠肝、腸系膜淋巴結組織中可見少量腸道細菌易位,腎組織中未發現腸道細菌易位。本實驗除發現老齡大鼠肝、腸系膜淋巴結組織中有少量腸道細菌易位外,腎組織中也發現了少量腸道細菌易位,這可能與老齡大鼠全身組織器官萎縮,腸黏膜各種屏障功能減弱有關。分泌型IgA(sIgA)是人類腸黏膜免疫屏障的主要抗體,它與多種疾病的發生、發展密切相關,特別和腸道感染、慢性鼻竇炎、呼吸道感染、泌尿生殖系統感染等關系密切。sIgA在腸黏膜局部免疫中發揮著重要作用,它們占據著黏膜表面,阻止細菌在腸黏膜表面停留、黏著、形成菌落〔7〕;可以和抗原結合形成大分子的復合物,阻止其進入細胞內;sIgA作為調理素與抗原結合,使細菌等微生物發生調理素化,增加黏膜表面單核巨噬細胞、中性粒細胞的表面吞噬作用;sIgA還能在小腸內結合和阻擋沒有經過消化的大分子蛋白質穿過腸黏膜,避免引起機體的變態反應〔8〕。

組胺是一種作用廣泛的單胺類物質,是肥大細胞和嗜堿性粒細胞脫顆粒的標志物,在胃腸道的含量尤為豐富。它可通過其 H1R、H2R、H3R、H4R4種受體參與多種生理功能調節,如胃腸分泌與蠕動、神經內分泌調節、免疫反應調節等。小劑量的組胺進入腸道后,可激活腸道中的肥大細胞使其脫顆粒釋放組胺,釋放的組胺又可激活鄰近的肥大細胞脫顆粒,形成自身放大機制進行調節〔9〕。老齡大鼠各種組織和器官都會出現不同程度的萎縮、功能下降,特別是免疫系統的功能下降明顯。席豐等〔10〕研究證明,小劑量組胺腸道灌注后可增加老齡大鼠腸黏膜對 sIgA的分泌,增強腸黏膜免疫屏障的保護作用。

大腸桿菌 O75進入小腸后,可在腸黏膜表面大量生長繁殖,導致腸黏膜上皮細胞變性、壞死,腸黏膜屏障受損,腸道內的細菌即可突破腸黏膜屏障進入門靜脈、腸淋巴系統引起腸道細菌易位。本實驗腸道感染組大鼠肝、腎、腸系膜淋巴結勻漿培養均有大量細菌生長,而腸道感染加組胺治療組肝、腎、腸系膜淋巴結勻漿培養細菌明顯減少,可能是因為組胺通過以下機制對腸黏膜屏障進行保護:①組胺具有擴張細小動脈改善腸道血液循環;②促進液體的滲出和白細胞的趨化作用,滲出液中的免疫球蛋白、補體、殺菌肽、溶菌酶、纖維素等,可中和毒素、殺滅細菌及增加白細胞的吞噬功能〔11〕;③促進腸蠕動、減少致病菌在腸道中停留的時間;④促進胃酸、膽汁和各種消化酶的分泌,抑制致病菌的生長;⑤促進黏液分泌維持腸道內正常微生態;⑥激活抗原提呈細胞,增強其提呈抗原、合成促炎細胞因子〔12〕參與細胞免疫和體液免疫〔13〕。

本研究提示,腸道感染時小劑量組胺腸內灌注,有減輕老齡大鼠腸黏膜屏障損傷、保護腸黏膜屏障、阻止腸道細菌易位的作用。

1 楊書良,李蘭梅,陳育民 .腸黏膜屏障的構成與功能研究進展〔J〕.臨床薈萃,2008;23(24):1809-11.

2 Rhee KJ,Sethupathi P,Driks A,et al.Role of commensal bacteria in development of gut-associated lymphoid tissues and preimmune antibody repertoire〔J〕.J Immunol,2004;172(2):1118-24.

3 Walser EM,Nealon WH,Marroquin S,et al.Sterile fluid collections in acute pancreatitis:catheter drainage versus simple aspiration〔J〕.Cardiovasc Intervent Radiol,2006;29(1):102-7.

4 黎介壽.腸衰竭-概念:營養支持與腸黏膜屏障維護〔J〕.腸外與腸內營養,2004;11(1):65-7.

5 陳 吉,吳國豪.腸道細菌移位的研究進展〔J〕.腸外與腸內營養,2004;11(5):309-12.

6 楊書良,劉惠民,戴景芳等 .組胺對失血大鼠模型腸黏膜屏障的保護作用〔J〕.中國老年學雜志,2008;28(23):2303-5.

7 Lamm ME,Phillips-Quagliata JM.Origin and homing of intestinal IgA antibody-secreting cells〔J〕.JExp Med,2002;195(2):F5-6.

8 Golby SJ,Spencer J.Where do IgA plasma cells in the gut come from〔J〕?Gut,2002;51(2):150-1.

9 謝 華,何韶衡.組胺對肥大細胞激活的研究〔J〕.中華微生物學和免疫學雜志,2004;24(3):168.

10 席 豐,高金生,楊書良.組胺對老齡大鼠腸黏膜分泌型 IgA分泌調節的影響〔J〕.中國老年學雜志,2009;29(22):2891-92.

11 呂艷青,栗原博.組胺在機體免疫反應中的作用〔J〕.中國藥理學通報,2007;23(1):13-5.

12 Takahashi HK,Iwagaki H,Mori S,et al.Histamine inhibits lipopolysaccharide-induced interleukin IL-18 production in human monocytes〔J〕.Clin Immunol,2004;112(1):30-4.

13 Mazzoni A,Young HA,Spitzer JH,et al.Histamine regulates cytokine production in maturing dendritic cells,resulting in altered T cell polarization〔J〕.JClin Invest,2001;108(12):1865-73.