補腎方藥血清孵育 BMSCs移植對腦缺血大鼠腦組織細胞凋亡的影響

劉永琦 吳曉晶 董介正 范 萍 孫少伯 顏春魯 (甘肅中醫學院,甘肅 蘭州 730020)

腦缺血性梗死是一種高發病率、高死亡率和高致殘率的疾病,嚴重威脅人類健康。細胞凋亡是造成腦缺血再灌注后遲發性持續神經細胞損傷不可忽視的重要因素〔1〕。因骨髓間充質干細胞(BMSCs)具有易于獲得、體外培養能快速擴增、可自體移植并能夠轉染和長期表達外源性基因等特征,使其極具研究優勢。近年來研究發現,BMSCs能局部和靜脈注射移植治療中樞神經系統損傷〔2～5〕。中醫藥在神經系統疾病的治療上具有顯著療效,補腎生髓法是臨床上治療腦血管疾病的常用治法。本文采用補益腎陽法、補益腎陰法、陰陽雙補法的代表方劑右歸丸、左歸丸、地黃飲子的動物含藥血清孵育BMSCs并移植到腦缺血大鼠體內,探討不同補腎法方藥孵育BMSCs對大鼠腦缺血再灌注模型腦組織細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 Wistar大鼠,SPF級,8只,雌雄不限,體重(120±10)g,用于提取 BMSCs;40只,雌雄不限,體重(250±20)g,用于制備中藥血清;84只,雌雄各半,體重(300±30)g,用于實驗造模。以上動物皆由甘肅中醫學院實驗動物中心提供,實驗動物質量合格證許可證編號:SCXK(甘)2004-0006-000001。

1.1.2 實驗藥物 左歸丸、右歸丸、地黃飲子均購于甘肅中醫學院附屬醫院藥劑科,方藥組成及劑量均參照第7版方劑學教材。

1.1.3 主要試劑和儀器 L-DMEM培養基(Gibco公司);胎牛血清 (杭州四季青生物工程材料有限公司);0.25%胰酶(Sigma公司);全反式維甲酸(ATRA,Sigma公司);CD45、CD90熒光標記抗體(Gibco公司);細胞凋亡檢測試劑盒(TUNEL)、兔抗大鼠 Caspase-3(武漢博士德生物工程有限公司);二氧化碳培養箱 (SANYO公司);超凈工作臺(蘇州凈化儀器廠);流式細胞儀(Beckman公司);熒光顯微鏡(Olympus)。

1.2 方法

1.2.1 動物含藥血清的制備 水煎法分別制備右歸丸、地黃飲子、左歸丸藥液(1 g生藥/ml)。40只 Wistar大鼠依照隨機數字表分為空白組、右歸丸組、地黃飲子組、左歸丸組。晚禁食,空白組按 10 ml/kg的量予以生理鹽水灌胃,余各組按10 ml/kg量灌服相應方藥煎劑,連續 3 d,2次/d;于第 3 d給藥后 2 h取血,分離血清,滅活、除菌、分裝,-20℃保存備用。

1.2.2 BMSCs的分離、純化 將大鼠脫臼處死,無菌條件下取出雙側股骨,除去骨表面附著組織,剪去兩端,用體積分數為75%的乙醇浸泡消毒 5～8 min,用含 10%胎牛血清的 DMEM培養液反復沖洗骨髓腔,收集沖洗液,1 000 r/min,10 min離心,棄去上清液,重新加入含 10%胎牛血清的 DMEM,用尖吸管吹打均勻;調整細胞密度,以 1×106個/ml的密度將細胞懸液接種到容量 25cm2培養瓶中,于 37℃、體積分數為 0.05的CO2培養箱中進行原代培養,每 3～4天換液 1次。待 BMSCs生長至 80%～90%融合時,用質量濃度為 0.25%的胰酶消化傳代。

1.2.3 BMSCs的鑒定 獲得第 3代 BMSCs,加入熒光標記CD90、CD45抗體,用流式細胞儀檢測細胞表面 CD90、CD45表達率。

1.2.4 BMSCs的孵育 將傳至第 3代的 BMSCs分別用內含10%空白組的大鼠血清的 DMEM培養液、0.01 mg/L ATRA、10%FBS L-DMEM培養液、10%相應含藥血清的 DMEM培養液于 37℃、氣體體積分數為 5%CO2培養箱內,飽和濕度條件下培養孵育。

1.2.5 局灶性腦缺血動物模型制備及實驗動物分組 采用Yuji等〔6〕所報道的線栓法建立 Wistar大鼠大腦中動脈缺血模型(MCAO)。參考Longa及Bederson評定神經功能缺損程度,對造模成功的大鼠按隨機數字表法隨機分為模型組、空白血清孵育 BMSCs移植組(簡稱 BMSCs組)、維甲酸孵育 BMSCs組(維甲酸組)、右歸丸血清孵育 BMSCs組(右歸丸組)、地黃飲子血清孵育 BMSCs組(地黃飲子組)、左歸丸血清孵育 BMSCs組(左歸丸組),另假手術組對照組。每組每個時間點各 6只。

1.2.6 BMSCs的移植 移植前對細胞進行消化后離心,收集,用生理鹽水漂洗 3次,進行細胞計數,重懸,每 1ml生理鹽水的細胞個數為 1×106個/ml,假手術、模型組大鼠尾靜脈注射生理鹽水1ml,其余各組大鼠于造模 24h后經尾靜脈輸入等量相應中藥孵育后的 BMSCs。

1.2.7 取材與標本處理 分別于移植后 7、14 d(每個時間點各 6只)用 10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠,手術充分暴露心臟,用4%的多聚甲醛溶液經升主動脈進行灌注固定,斷頭后剪開顱板取出全腦,以前囟為中心前后 1 mm(病變損害的中心),冠狀切取大鼠腦組織,置于 4%多聚甲醛固定液中,常規石蠟包埋,待做免疫組化測定。

1.2.8 TUNEL法檢測腦組織細胞凋亡的變化 將石蠟包埋標本行冠狀切片,按試劑盒說明書進行操作。陽性反應細胞的胞質為棕黃色;隨機選取缺血側皮層 5個視野;每組觀察 6張切片,合計 30個視野;計數陽性細胞,計算平均值。

1.2.9 Caspase-3表達的變化 采用免疫組織化學法,石蠟包埋標本行冠狀切片,按試劑盒說明書進行操作。陽性反應細胞的胞質為棕黃色;隨機選取缺血側皮層 5個視野;每組觀察 6張切片,合計 30個視野;計數陽性細胞,計算平均值。

1.3 統計學處理 應用 SPSSl 6.0統計軟件進行分析,結果數據以±s表示,多樣本均數比較采用方差分析。

2 結 果

2.1 BMSCs的分離、鑒定及孵育 原代細胞培養 3d后觀察,即可見大量貼壁細胞,細胞完全舒展并呈現多種形態,主要為長梭形、成纖維樣;4～5 d左右細胞數量明顯增加,集落漸擴大,約8～9d基本鋪滿瓶壁形態為較均一長梭形。原代培養過程中可見部分懸浮造血細胞,經數次換液后其基本消失。傳代細胞呈均勻分布,生長迅速,約3～4 d可鋪滿瓶壁,細胞多呈梭形。且傳至 3代的細胞形態單一均勻,融合后呈典型的極性,漩渦狀生長。經流式細胞術檢測,所培養的 3代BMSCs高表達BMSC表面標志分子 CD90(97.1%),而極低表達造血細胞表面分子 CD45(0.1%),CD90+CD45-細胞為 97.1%,符合 2006年國際細胞治療協會(ISCT)給出的 BMSC的定義標準〔7〕。

2.2 各組大鼠腦組織細胞凋亡的變化 假手術組有少量陽性表達,模型組 7d、14 d缺血中心區和半暗帶區腦組織細胞凋亡數較假手術組顯著增多(P＜0.01)。與模型組比較,各治療組7 d、14d腦組織細胞凋亡數減少顯著(P＜0.05,P＜0.01)。地黃飲子組、左歸丸組 7 d、14 d腦組織細胞凋亡數與 BMSCs、維甲酸、右歸丸組比較顯著減少 (P＜0.05,P＜0.01)。

2.3 各組大鼠腦組織 Caspase-3表達的變化 假手術組有少量 Caspase-3陽性表達,模型 7 d、14 d組較假手術組明顯增多(P＜0.01)。與模型組比較,各移植組 7 d、14 d的 Caspase-3表達均有顯著減少,差異有統計學意義(P＜0.05,P＜0.01)。地黃飲子組、左歸丸組 7 d、14 d腦組織的 Caspase-3表達與 BMSCs、維甲酸、右歸丸組比較顯著減少,差異有統計學意義(P＜0.05,P＜0.01)。見表 2。

表1 各組大鼠腦組織TUNEL陽性細胞比較(個/HP,±s)

表1 各組大鼠腦組織TUNEL陽性細胞比較(個/HP,±s)

與假手術組比較:1)P＜0.01;與模型組比較:2)P＜0.05,3)P＜0.01;與 BMSCs組比較:4)P＜0.05,5)P＜0.01;與維甲酸組比較:6)P＜0.05,7)P＜0.01;與右歸丸組比較:8)P＜0.05,9)P＜0.01;下表同

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表2 各組大鼠腦組織 Caspase-3表達變化比較(個/HP,±s)

表2 各組大鼠腦組織 Caspase-3表達變化比較(個/HP,±s)

分組 n 7 d 14 d假手術組 6 10.03±1.38 9.70±1.68模型組 6 26.13±4.401) 24.03±4.571)BMSCs組 6 24.10±4.662) 22.03±4.252)維甲酸組 6 22.07±4.563)4) 20.10±4.023)4)右歸丸組 6 23.73±4.132) 21.80±4.292)左歸丸組 6 19.53±3.913)5)6)9) 17.70±3.723)5)6)9)地黃飲子組 6 18.87±3.163)5)7)9) 16.77±3.073)5)7)9)

3 討 論

BMSCs易于體外分離、擴增,具有良好的多向分化潛能等優良特征而被認為是可用于臨床細胞學治療的最佳干細胞之一〔8,9〕。腦缺血再灌注損傷后引起能量衰竭和酸中毒,產生大量的自由基、興奮性氨基酸對腦細胞產生損害,磷脂代謝的異常、積聚,同時促使離子自穩機制破壞,導致細胞內鈣超載,這些最終引起某些原癌基因的表達,誘導凋亡的發生。腦缺血后,神經元的死亡是一個極其復雜的病理過程,主要表現為壞死和凋亡兩種形式,在腦缺血急性期,神經元壞死與凋亡并存,細胞壞死位于缺血中心區,細胞凋亡主要出現在缺血半暗帶。而在腦缺血的遲發性神經元死亡期,則以細胞凋亡為主。Caspase家族可特異地在天門冬氨基酸殘基后裂解靶蛋白。Caspase-3是 Caspase級聯“瀑布”下游最關鍵的凋亡執行蛋白酶。在各種因素啟動的凋亡程序中起最后樞紐作用。在神經系統中 Caspase-3不僅可以促進腦發育時期神經元的凋亡,還可以促進各種因素誘導培養的神經元凋亡,Caspase-3可能是缺血神經元凋亡的重要效應分子〔10〕。本研究結果表明,BMSCs移植能減少腦缺血大鼠腦組織細胞凋亡數,抑制 Caspase-3的陽性表達。提示抑制腦組織細胞凋亡可能是BMSCs移植治療腦缺血損傷的作用機制之一。

1 楚 冰,邵國富.腦缺血后遲發性神經元死亡及分子機制〔J〕.國外醫學?腦血管疾病分冊,1999;7(6):330-2.

2 Chopp M,Zhang XH,Li Y,et al.Spinal cord injury in rat:treatment with bone marrow stromal cell transplantation〔J〕.Neuroreport,2000;11(13):3001-5.

3 Chen J,Li Y,Wang L.Therapeutic benefit of intravenous administration of bone marrow stromal cells after cerebral ischemia in rats〔J〕.Stroke,2001;32(4):1005-11.

4 曹勇軍,程彥斌.線栓法建立大鼠局灶性腦缺血/再灌注模型的改進與探討〔J〕.中國應用生理學雜志,2001;17(2):198-200.

5 許予明,秦 潔,邢 瑩,等.體外誘導大鼠骨髓間充質干細胞向神經細胞分化〔J〕.鄭州大學學報(醫學版),2004;39(2):269-71.

6 Yuji K,Kazuo M,Takenori Y,et al.Nylonmomofilament for intraluminal middle cerebral artery ocelusion in rat〔J〕.Stroke,1995;26:1655-7.

7 Dominici M,Le Blanc K,Mueller I,et al.Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells.The International Society for Cellular herapy position statement〔J〕.Cytotherapy,2006;8(4):315-7.

8 覃小華,尚希福.骨髓間充質干細胞橫向分化及臨床應用研究進展〔J〕.醫學綜述,2009;15(1):38-40.

9 范 萍,劉永琦,吳曉晶,等.不同條件下骨髓間充質干細胞分離培養及其生物學特性研究〔J〕.細胞與分子免疫學雜志,2010;26(4):322-4.

10 Yuan J,Yankner BA.Apoptosis in the nervous system〔J〕.Nature,2000;407(6805):802-9.