酸櫻桃汁對衰老模型小鼠的抗衰老作用及其機制

王春梅 李香艷 崔新穎 (北華大學藥學院,吉林 吉林 132013)

研究表明櫻桃富含多種維生素、花青素、各種花色苷、花色素、褪黑激素、多種酚類化合物等有效成分,具有調節睡眠、清除自由基、抗氧化、抗炎、鎮痛、抗癌、保護心血管系統功能、降低血脂、改善糖尿病等作用〔1〕。而近年國外研究資料顯示酸櫻桃含有更為豐富的酚醛類物質如花色苷等,其藥用價值遠遠高于甜櫻桃〔2〕,但國內有關酸櫻桃的藥理學研究報道較少。本研究采用從加拿大 Alberta引進的 Evans和 SK Carmine Jewel高產、優良和抗逆性強的酸櫻桃新品種,自制酸櫻桃汁(PCLJ),利用 D-半乳糖衰老小鼠模型,通過行為學、功能學以及病理形態學等層面研究酸櫻桃汁的抗衰老作用,并初步探討其抗衰老作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物 純系昆明種小鼠,雌雄各半,6周齡,體重(20±2)g,由長春高新區醫學實驗動物中心提供,合格證號:SCXK 2(吉)200322004。各組小鼠同室分籠飼養,顆粒飼料喂養,自由飲水。

1.2 藥品及試劑 PCLJ由北華大學藥學院藥理教研室自制;D-半乳糖購至國藥集團化學試劑有限公司,批號:F20050711;維生素 E膠丸為昆明圣火制藥有限責任公司生產,批號:20051002。丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、脂褐素、膽堿酯酶(AChE)檢測試劑盒均購自南京建成生物技術有限公司。

1.3 模型建立及給藥方法 昆明種小鼠適應性飼養 1 w后,將動物隨機分為 6組:正常對照組、衰老模型組、維生素 E組、PCLJ低、中、高劑量組,每組 20只。模型組和給藥組小鼠每日接受頸背部皮下注射 D-半乳糖 120 mg/kg(生理鹽水配制),連續 8 w〔3,4〕,對照組注射等量的生理鹽水;同時給藥組小鼠每日分別灌胃相應劑量的維生素 E(50 mg/kg)或 PCLJ(5,10,20 ml/kg),正常對照組和衰老模型組小鼠灌胃等量的生理鹽水,連續 8w。

1.4 學習記憶能力測試(小鼠跳臺實驗) 實驗裝置為一長方形反射箱,大小為 32 cm ×22.5 cm ×33 cm,用黑色塑料板分隔成 6間。底面鋪以銅柵,間距為 0.5 cm,每間左角置一高度和直徑均為 4.5 cm的橡膠平臺。將小鼠放入反應箱內適應環境 3 min,然后立即通以 32 V交流電,其正常反應是跳回平臺以躲避傷害性刺激。如此訓練 5 min,24 h后重做測試,記錄動物第 1次跳下平臺的潛伏期和 5 min之內跳下平臺受到電擊的次數(錯誤次數)〔5〕。

1.5 檢測指標 學習記憶實驗結束后,準確稱量每只小鼠體重并記錄。斷頭處死后立即于冰臺上取出全腦、胸腺、脾組織,用預冷的生理鹽水反復沖洗,用濾紙吸干,電子天平稱量全腦、脾和胸腺的重量。用于切片的腦組織置于10%甲醛中固定,其余臟器組織用錫箔紙包好,置-80℃超低溫冰箱保存待用。

1.5.1 各臟器指數的測定 準確稱取小鼠全腦、胸腺、脾臟濕重后,計算各臟器指數(mg/g)〔胸腺重量(mg)/體重(g)〕。

1.5.2 腦組織中生化指標的測定 將凍存的腦組織放入組織勻漿機配用的玻璃管中,加入 9倍體積預冷的生理鹽水(蒸餾水),充分研磨后,制成 10%腦組織勻漿。采用考馬斯亮藍法測定腦組織勻漿中總蛋白含量;硫代巴比妥酸反應物法測定MDA含量;酶法檢測GSH-Px和AChE的活性;熒光法測定腦組織中脂褐素含量。具體檢測方法參照試劑盒說明書。

1.6 小鼠大腦組織病理形態學檢測 取 10%甲醛溶液固定的腦組織標本,切取左、右大腦頂部及顳部皮質組織(4 mm×4 mm×3 mm),將其置于 70%、80%的酒精中各漂洗 15 min,然后以 90%、100%酒精,100%酒精+丙酮,二甲苯依次脫水,透明,浸蠟,包埋,制成 4μm石蠟切片,行蘇木素-伊紅(HE)染色,光學顯微鏡下觀察、拍照。

2 結 果

2.1 PCLJ對衰老小鼠跳臺實驗的影響 在第 1天的學習測試中,模型組小鼠 5 min內錯誤次數較正常對照組明顯增多,PCLJ中、高劑量組小鼠 5 min內錯誤次數較模型組明顯減少(P＜0.01,P＜0.001)。在第 2天的記憶測試中,模型組小鼠第1次跳下平臺的潛伏期較正常對照組顯著縮短,5 min內錯誤次數明顯減少(P＜0.001),PCLJ低、中、高劑量組小鼠第 1次跳下平臺的潛伏期明顯延長,5 min內錯誤次數明顯減少(P＜0.05～0.001),并呈劑量依賴性。見表 1。

2.2 PCLJ對衰老小鼠臟器指數的影響 與正常對照組比較,模型組小鼠腦、胸腺、脾指數均顯著減小(P＜0.01～0.001)。PCLJ低、中、高劑量組小鼠腦、胸腺、脾指數明顯增大,并呈劑量依賴性。見表 2。

2.3 PCLJ對衰老小鼠腦組織 MDA、GSH-Px、AChE及脂褐素的影響 與正常對照組比較,模型組小鼠腦組織 MDA及脂褐素含量顯著提高,差異有統計學意義(P＜0.01),GSH-Px活性明顯降低(P＜0.01),而 AChE活性明顯升高。PCLJ中、高劑量組小鼠腦組織MDA及脂褐素含量顯著降低,GSH-Px活性明顯升高,AChE活性顯著降低,差異有統計學意義(P＜0.01),并呈劑量依賴性。見表 2。

表1 PCLJ對衰老小鼠跳臺實驗的影響(±s,n=20)

表1 PCLJ對衰老小鼠跳臺實驗的影響(±s,n=20)

與正常對照組比較:1)P＜0.01,2)P＜0.001;與模型組比較:3)P＜0.05,4)P＜0.01,5)P＜0.001,下表同

組別 劑量(ml/kg)錯誤次數(次) 記憶能力(5 min)潛伏期(s) 錯誤次數(次)正常對照組 - 2.87±0.74 185.20±51.67 1.53±0.83衰老模型組 - 4.06±0.882)136.87±52.291) 2.87±0.922)PCLJ(低)組 5 3.33±0.82 179.00±57.373) 2.13±0.923)PCLJ(中)組 10 3.20±0.774)188.93±54.724) 1.93±0.804)PCLJ(高)組 20 2.93±0.705)207.67±57.995) 1.60±0.835)維生素 E組 50 mg/kg 3.53±0.743)176.80±55.593) 2.33±0.723)

表2 PCLJ對衰老小鼠臟器指數和腦組織中生化指標的影響(±s,n=20)

表2 PCLJ對衰老小鼠臟器指數和腦組織中生化指標的影響(±s,n=20)

組別 劑量(ml/kg)腦指數(mg/g)胸腺指數(mg/g)脾指數(mg/g)MDA(nmol/ml)GSH-Px(U)AChE(U/mgprot)脂褐素(μg/g)正常對照組 - 14.53±1.12 2.17±0.16 3.18±0.29 4.96±0.21 0.27±0.04 0.28±0.06 0.523±0.056衰老模型組 - 12.51±1.132) 1.77±0.272) 2.76±0.271) 5.46±0.261) 0.23±0.031) 0.36±0.071)0.638±0.0841)PCLJ(低)組 5 13.37±0.923) 1.89±0.19 2.97±0.183) 5.28±0.36 0.24±0.02 0.32±0.01 0.590±0.036 PCLJ(中)組 10 13.63±0.894) 2.01±0.323) 3.05±0.264) 5.18±0.272) 0.25±0.032) 0.30±0.022)0.576±0.0322)PCLJ(高)組 20 14.06±0.895) 2.12±0.204) 3.18±0.275) 4.98±0.393) 0.27±0.033) 0.29±0.023)0.548±0.0573)維生素 E組 50 mg/kg 13.28±0.783) 1.94±0.21 2.96±0.203) 5.35±0.225 0.25±0.032) 0.31±0.032)0.581±0.0512)

2.4 PCLJ對衰老小鼠腦組織病理形態學的影響 正常對照組小鼠大腦皮質神經細胞豐富,排列整齊,著色正常;模型組小鼠大腦皮質神經細胞數量顯著減少,排列疏松,殘存神經細胞固縮變圓,著色變淺;PCLJ低劑量組小鼠大腦皮質神經細胞形態結構介于正常對照組和衰老模型組之間;PCLJ高劑量組小鼠大腦皮質神經細胞略減少,部分神經細胞胞體變小或者淡染。

圖1 PCLJ對衰老小鼠腦組織病理形態學的影響(HE,×100)

3 討 論

本研究采用 D-半乳糖小鼠皮下注射 8 w,造成亞急性衰老小鼠模型〔6〕,其一般狀態欠佳,跳臺實驗結果表明模型組小鼠學習記憶能力顯著減退,而PCLJ治療組小鼠毛色光澤、精神狀態良好,學習記憶能力明顯改善。

組織器官的重量,特別是腦、胸腺、脾、肝、腎等重要器官的重量變化是反映生物體衰老程度的重要指標〔7〕。免疫器官衰變最明顯的是胸腺和脾,胸腺和脾重量的降低、萎縮、功能衰退可使免疫功能降低,導致老年動物(人)惡性疾病發生率增高,加速老化進程。本研究結果顯示 D-半乳糖誘導的亞急性衰老小鼠腦、胸腺和脾臟指數均顯著下降,PCLJ治療明顯提高了衰老小鼠腦、胸腺及脾臟重量,說明PCLJ能夠有效對抗小鼠腦的衰老,保持機體的免疫功能,提高抗病能力,從而對延緩衰老具有積極的意義。

衰老機體氧化系統和抗氧化系統的動態平衡遭到破壞。MDA是脂質過氧化的主要產物之一,其在腦組織中的水平隨著年齡的增加而升高,可反映自由基對機體的損傷程度〔8〕。脂褐素是 MDA與含有游離氨基酸的蛋白質、磷脂酰乙醇胺及核酸等物質進一步作用形成的一種有自發熒光的復合物,終身存在于細胞內,又稱老年色素,其含量隨著老化增加,逐漸充盈細胞,甚至取代細胞核,是目前公認的老化標志之一。本實驗表明 PCLJ可明顯降低 D-半乳糖致衰老小鼠腦組織 MDA含量,中、高劑量組可顯著降低腦組織脂褐素的含量,提示其可減輕脂質過氧化損傷,而發揮抗衰老作用。

GSH-Px是廣泛存在于機體內的一種重要的催化過氧化分解的酶,它特異性地催化 GSH對過氧化氫的還原反應,抑制煙酸胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)形成 OH-,削弱對脂質過氧化作用的損傷,從而起到保護細胞膜結構和功能完整的作用。本實驗結果表明 PCLJ可顯著提高 D-半乳糖致衰老小鼠腦組織GSH-Px活性,提高體內抗氧化酶活性,減輕自由基對生物大分子的傷害。研究表明中樞膽堿能神經功能與學習記憶密切相關〔9〕,乙酰膽堿(ACh)是經典的膽堿能神經遞質,以興奮作用為主,亦有抑制作用。ACh在調節學習和記憶尤其是近期記憶方面具有重要作用,是促進學習記憶的神經遞質。而 AChE是水解 ACh的酶,AChE活性增高,間接說明膽堿能神經系統功能減退導致學習記憶障礙。本實驗結果表明酸櫻桃汁中、高劑量組小鼠腦組織 AChE活性較模型組明顯降低,提示PCLJ對衰老模型小鼠的學習記憶有明顯的改善作用,可能與抑制腦內AChE合成,減少 ACh水解,保護腦組織神經有關。

此外,病理形態學研究結果亦顯示PCLJ能夠明顯改善D-半乳糖致衰老小鼠大腦皮質切片的形態結構改變。

酸櫻桃果實具有清除自由基、抗氧化等作用,并能保護神經細胞免于氧化應激損傷,有很強的減慢神經退行性改變的作用〔10,11〕,從而改善衰老的行為學變化,提高衰老小鼠的學習記憶能力,延緩衰老的進程。本研究為將酸櫻桃開發成為抗衰老功能性食品和藥品提供了理論依據。有關酸櫻桃抗衰老作用的分子機制及其主要有效成分仍需要進一步研究和探討。

1 崔新穎,李香艷,孔祥雨,等 .酸櫻桃果實有效成分及藥理作用的研究〔J〕.北華大學學報(自然科學版),2007;8(2):145-9.

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3 朱慶磊,楊 契,薛 橋,等 .人工致衰老和自然衰老小鼠抗氧化能力改變的對比研究〔J〕.中國老年學雜志,2003;23(7):448-50.

4 余資江,應大君,董世武,等 .半乳糖急性致衰老動物模型劑量的探討〔J〕.解剖學雜志,2005;28(4):422-4.

5 張 丹,王亞芳,張建軍 .藏藥旺拉提取物 CE對亞急性衰老小鼠學習記憶及抗氧化能力的影響〔J〕.中國新藥雜志,2005;14(11):1301-3.

6 Leutner S,Eckert A,Müller WE.ROSgeneration,lipid peroxidation and antioxidant enzyme activities in the aging brain〔J〕.J Neural Transm,2001;108(8-9):955-67.

7 劉 濤,王燦暉,楊 進,等 .改良三甲散抗腦衰老的實驗研究〔J〕.中國老年醫學雜志,2001;21(7):308-9.

8 師繡章.自由基導致衰老與自由基防衰老的研究〔J〕.中華老年醫學雜志,1985;4(2):122-4.

9 Muir JL.Acetylcholine,aging,and Alzheimer′s disease〔J〕.Pharmacol Biochem Behav,1997;56(4):687-96.

10 Ramona Lichtenth,Friedhelm Marx.Total oxidant scavenging capacities of common european fruit and vegetable juices〔J〕.J Agric Food Chem,2005;53(1):103-10.

11 Kim DO,Heo HJ,Kim YJ,et al.Sweet and sour cherry phenolics and their protective effects on neuronal cells〔J〕.J Agric Food Chem,2005;53(26):9921-7.