熄風(fēng)止顫合劑對(duì) PSI誘導(dǎo)的帕金森病模型大鼠腦的影響

周風(fēng)華 李文通 李媛媛 任 凡 劉雨清 (濰坊醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室,山東 濰坊 261053)

帕金森病(PD)是一種以運(yùn)動(dòng)機(jī)能障礙為主的老年神經(jīng)退行性疾病,隨著人口老齡化的加劇及壽命的延長(zhǎng),PD的發(fā)病率逐漸增高。其臨床癥狀以肢體不自主震顫、肌肉強(qiáng)直、進(jìn)行性運(yùn)動(dòng)遲緩為主。其病理學(xué)改變表現(xiàn)為黑質(zhì)-多巴胺能神經(jīng)元退化及紋狀體多巴胺水平的降低。左旋多巴類藥物是臨床治療PD最常用的藥物,但長(zhǎng)期服用此藥會(huì)產(chǎn)生諸多的副作用,近年來(lái)中藥治療 PD逐漸受到重視。本實(shí)驗(yàn)采用皮下注射蛋白酶抑制劑(PSI)成功構(gòu)建 PD慢性大鼠模型,觀察熄風(fēng)止顫合劑對(duì)PD大鼠行為學(xué)及大腦黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元的影響,探討熄風(fēng)止顫合劑對(duì) PD的治療作用及可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 SD大鼠,雄性,36只,體重約 200 g,購(gòu)自山東大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 藥物 熄風(fēng)止顫合劑由黃芪、當(dāng)歸、何首烏、白芍、龜板、天麻、三七粉、蜈蚣、水蛭、僵蠶、石菖蒲、膽星、甘草等組成,將每種中藥成品按一定比例混合,加入蒸餾水,配制成混懸液,消毒玻璃瓶密閉盛裝,冰箱 4℃保存?zhèn)溆谩Ｒ陨纤兄兴幊善肪蔀H坊市中醫(yī)院中風(fēng)科提供。美多巴由上海羅氏制藥公司生產(chǎn),批號(hào):010813,研磨成粉后溶解于蒸餾水中,配制成劑量為 200 mg/kg的混懸液,現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.1.3 試劑 造模劑:PSI購(gòu)自Calbiochem公司,Catalog number:539160,-20℃冷凍保存。PSI的溶解配制方法:將室溫放置的 100%無(wú)水乙醇直接倒入PSI小瓶中,然后加蒸餾水,稀釋為 70%乙醇濃度。兔抗酪氨酸羥化酶(TH)抗體,1∶400,Pei-Freez Bioloicals產(chǎn)品(USA)原位末端標(biāo)記(Tunel)試劑盒(ZK-8004)購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)有限公司。

1.1.4 儀器 H-7500型透射電鏡,由日本日立公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 建模、分組及給藥 36只 SD大鼠隨機(jī)選擇 8只作為空白對(duì)照,28只大鼠造模處理。應(yīng)用文獻(xiàn)〔1,2〕所介紹的 PSI皮下注射法,隔日(每周一、三、五)給予 28只大鼠背部皮下注射PSI溶液,150μl/只,連續(xù) 2 w,正常對(duì)照組大鼠給予同等量的70%乙醇溶液背部皮下注射。PD造模成功后將造模成功的大鼠隨機(jī)分為三組,中藥組 10只,美多巴組 10只,模型組 8只。造模 4 w后,按熄風(fēng)止顫合劑 1.28 g/kg,美多巴 200 mg/kg、生理鹽水 2.5 ml/d的劑量,分別灌胃給藥,連續(xù) 3 w。

1.2.2 體重及行為學(xué)觀察 實(shí)驗(yàn)期間每日觀察并記錄各組大鼠的體毛、梳理動(dòng)作、站立次數(shù)、肢體震顫、僵直等行為,造模期間及造模結(jié)束后的 4 w內(nèi)每周稱重一次,給藥期間及給藥結(jié)束后 3 w每日稱重一次。

1.2.3 標(biāo)本采集 灌胃給藥 3 w后,10%水合氯醛腹腔注射麻醉,4%多聚甲醛溶液,灌注。迅速開(kāi)顱取鼠全腦,取出黑質(zhì),放入 10%的中性甲醛中固定用于 HE染色、免疫組織化學(xué)及TUNEL檢測(cè)。部分黑質(zhì)切取成體積約為 1 mm3左右的組織塊,立即置于戊二醛固定液中后固定用于電鏡檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用 SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件,數(shù)據(jù)以±s表示,獨(dú)立樣本采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠行為學(xué)改變 造模大鼠注射 PSI結(jié)束后,逐漸出現(xiàn)不自主咀嚼,站立次數(shù)、梳理動(dòng)作增多;PSI注射結(jié)束后第 4周癥狀較明顯,大鼠主要表現(xiàn)為采食量減少毛發(fā)粗糙無(wú)光澤、污穢,前爪出現(xiàn)顫抖,行走時(shí)重心明顯降低,伸展姿態(tài)時(shí)腹部接觸地面,運(yùn)動(dòng)遲緩,四肢和軀體的伸展緩慢。第五周開(kāi)始治療,美多巴治療組在治療 1 w后,采食量漸穩(wěn)定,體重降低幅度減小,脫毛現(xiàn)象減輕,震顫癥狀略改善,步態(tài)稍穩(wěn),隨著治療時(shí)間延長(zhǎng)震顫癥狀明顯改善;中藥治療組,治療約 2 w后,采食量不再減少且逐漸增加,體重穩(wěn)定亦逐漸增加之后維持在較高的水平,比美多巴治療組同期體重略增加,震顫癥狀明顯改善,且癥狀改善較美多巴組更明顯。

2.2 黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元的改變

2.2.1 TH免疫組織化學(xué) 陽(yáng)性表達(dá)部位位于黑質(zhì)致密部多巴胺神經(jīng)元的胞質(zhì),細(xì)胞排列呈條帶狀。與空白組比較,模型組黑質(zhì)致密部的多巴胺神經(jīng)元數(shù)量明顯減少(P﹤ 0.05),殘存神經(jīng)元體積大小不等,形態(tài)不規(guī)則。美多巴治療組,黑質(zhì)致密部多巴胺神經(jīng)元數(shù)量空白組減少,但較模型組數(shù)量略增加。中藥治療組,黑質(zhì)致密部多巴胺神經(jīng)元較空白組減少,但較美多巴治療組進(jìn)一步增加,且殘存神經(jīng)元體積及形態(tài)與正常神經(jīng)元差異較小。見(jiàn)圖 1,表 1。

2.2.2 TUNEL檢測(cè) 陽(yáng)性表達(dá)部位為細(xì)胞核,呈棕黃色顆粒狀。在四組動(dòng)物中,模型組陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量最多,其后依次為美多巴組,中藥組,空白組。見(jiàn)表 1。

表1 免疫組織化學(xué)染色TH陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)及細(xì)胞凋亡指數(shù)(±s)

表1 免疫組織化學(xué)染色TH陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)及細(xì)胞凋亡指數(shù)(±s)

與空白組比較:1)P＜0.05;與模型組比較:2)P＜0.05,3)P＜0.01

組別 n 免疫組化染色 凋亡指數(shù)(%)空白組 8 26.25±0.34 10.12±0.16模型組 8 8.12±0.151) 25.23±0.87美多巴組 10 15.36±0.832) 21.56±0.25中藥組 10 22.51±0.493) 16.84±0.56

圖1 各組TH免疫組化陽(yáng)性表達(dá)(×400)

2.2.3 超微結(jié)構(gòu)改變 模型組:電鏡下可見(jiàn)大鼠黑質(zhì)超微結(jié)構(gòu)發(fā)生病理性改變,其胞膜明顯內(nèi)陷或不連續(xù),胞核形狀不規(guī)則,核內(nèi)染色質(zhì)凝集,呈斑塊狀,大小不等,有小的溶解灶,核仁邊移細(xì)胞器結(jié)構(gòu)不清,線粒體體積增大,密度降低,嵴呈不同程度的溶解,部分線粒體呈空泡樣變或髓樣變,高爾基復(fù)合體囊泡變,核糖體明顯減少。美多巴治療組:電鏡顯示黑質(zhì)神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)部分線粒體有空泡樣改變,嵴斷裂,但少數(shù)神經(jīng)元已基本上恢復(fù)到正常形態(tài),神經(jīng)元內(nèi)有豐富的核糖體和發(fā)達(dá)的高爾基復(fù)合體,細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)雙核仁。中藥治療組:電鏡顯示黑質(zhì)神經(jīng)元內(nèi)出現(xiàn)大量粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng),高爾基復(fù)合體發(fā)達(dá),線粒體結(jié)構(gòu)完整,嵴清晰可辨,已基本上恢復(fù)到正常形態(tài),核染色質(zhì)細(xì)顆粒狀,偶見(jiàn)部分線粒體有空泡樣改變、髓樣變。

3 討 論

PD是一種中老年人最常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病,其病理學(xué)改變表現(xiàn)為黑質(zhì)-多巴胺能神經(jīng)元退化及紋狀體多巴胺水平的降低。目前,人類對(duì)于 PD的研究以動(dòng)物模型為主。其中,6-羥基多巴胺模型、魚(yú)藤酮模型、果蠅模型、α-synuclein小鼠模型、MPTP模型是最常用的幾種造模方法。本實(shí)驗(yàn)選擇了McNaught〔1〕等研究建立的應(yīng)用 PSI導(dǎo)致進(jìn)行性神經(jīng)變性的慢性動(dòng)物模型,離體和活體研究顯示PSI可以導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元變性。給予PSI的動(dòng)物逐漸出現(xiàn)進(jìn)行性帕金森綜合征,伴隨有Lewy小體形成和多巴胺能細(xì)胞壞死和凋亡,與人類PD病理類型相似,能夠較大程度的模擬人類 PD的發(fā)病過(guò)程。該造模方法最大的特點(diǎn)是慢性動(dòng)物模型,體征、癥狀、形態(tài)學(xué)表現(xiàn)等更接近臨床;造模過(guò)程操作簡(jiǎn)單,較目前最常用的經(jīng)顱注射法極大降低了動(dòng)物的死亡、感染等并發(fā)癥的發(fā)生;動(dòng)物模型的多巴胺能神經(jīng)元病變呈進(jìn)行性,行為異常和運(yùn)動(dòng)障礙等癥狀持久、不發(fā)生自行恢復(fù)。

PD的病因和發(fā)病機(jī)制目前仍未完全闡明,多數(shù)研究者認(rèn)為,PD的發(fā)生與多巴胺神經(jīng)元的凋亡有關(guān)。曹非等〔3,4〕通過(guò)對(duì)6-羥基多巴胺大鼠模型的研究發(fā)現(xiàn),PD組中黑質(zhì)細(xì)胞凋亡明顯增加,且可能與促凋亡因子 Bax的高表達(dá)有關(guān)。郭明〔5〕等也通過(guò)MPTP小鼠模型研究發(fā)現(xiàn),MPTP可通過(guò)其中間產(chǎn)物 MPP+促進(jìn)黑質(zhì)神經(jīng)元的凋亡,而誘導(dǎo) PD的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫熒光、TUNEL等方法,發(fā)現(xiàn) PSI誘導(dǎo)的 PD大鼠黑質(zhì)神經(jīng)元的凋亡細(xì)胞較正常對(duì)照組明顯增多,因此 PSI誘導(dǎo)的 PD與細(xì)胞凋亡有關(guān)。

目前,還沒(méi)有特異的根本治療本病的方法,左旋多巴制劑自六十年代應(yīng)用于臨床治療以來(lái),一直都是臨床上治療 PD的核心藥物,長(zhǎng)期服用此藥會(huì)產(chǎn)生諸多的副作用。近年來(lái),中醫(yī)藥防治 PD取得可喜成果。其治療主要遵從以下 4個(gè)法則:熄風(fēng)止顫法、補(bǔ)陰法、滌痰法、活血化瘀法,其中熄風(fēng)止顫法是臨床應(yīng)用最廣泛的一種方法。本實(shí)驗(yàn),用熄風(fēng)止顫合劑對(duì) PSI誘導(dǎo)的 PD大鼠進(jìn)行治療,發(fā)現(xiàn)其癥狀有明顯改善。免疫組織化學(xué)和免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn),中藥組黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元數(shù)量均比模型組明顯增多,由此說(shuō)明熄風(fēng)止顫合劑對(duì)PD有一定療效。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)還通過(guò)TUNEL法,對(duì)美多巴及熄風(fēng)止顫合劑進(jìn)行對(duì)照,檢測(cè)發(fā)現(xiàn),美多巴能夠減少黑質(zhì)神經(jīng)元的凋亡,這一結(jié)果與何成建等〔7〕的發(fā)現(xiàn)是一致的,熄風(fēng)止顫合劑亦能減少黑質(zhì)神經(jīng)元的凋亡,且凋亡的細(xì)胞數(shù)量較美多巴組進(jìn)一步減少。電鏡檢測(cè)也提示熄風(fēng)止顫合劑能夠更好地改善殘存黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu),從而改善黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元的功能。

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