黃芪注射液對缺氧缺糖/復氧復糖大鼠海馬神經元 bcl-2、bax及 cyt-c蛋白形態學表達的影響

焦俊霞 高維娟 錢 濤 李玉明 閆鳳霞 周曉春 (承德醫學院病理生理學教研室,河北 承德 067000)

黃芪,為豆科植物蒙古黃芪或莢膜黃芪的干燥根,主要功效為“補氣固表,利尿脫毒、排膿、斂瘡生肌”,受到歷代著名醫學家的重視,臨床應用極為廣泛。黃芪注射液主要成分為多糖、皂甙、黃酮等,具有擴張微細動脈、改善微循環、增強心肌收縮力、降低血小板黏滯度和保護紅細胞變形能力等功能,臨床上多用于治療心、腦血管疾病。張雅麗等〔1〕報道黃芪注射液可以抑制缺氧缺糖后復氧復糖大鼠海馬神經細胞的凋亡,但其干預海馬神經細胞凋亡機制,目前尚不清楚。本實驗通過對原代培養的大鼠海馬神經元建立缺氧缺糖/復氧復糖模型來模擬腦缺血/再灌注病理生理過程,觀察黃芪注射液對缺氧缺糖/復氧復糖大鼠海馬神經元 bcl-2、bax及 cyt-c蛋白表達的影響,探討黃芪注射液抑制神經細胞凋亡的分子機制。

1 材料與方法

1.1 動物 SD大鼠,新生 1～2 d,雌雄兼有,SPF級動物,由天津山川紅實驗動物科技有限公司提供,許可證號:SCXK(津)2009-001。

1.2 試劑和儀器 兔抗大鼠 NSE多克隆抗體購于武漢博士德公司;兔抗大鼠 bcl-2多克隆抗體購于美國 Chemicon公司;小鼠抗大鼠cyt-c單克隆抗體、小鼠抗大鼠bax單克隆抗體購于Santa cruz公司;多聚賴氨酸、阿糖胞苷購自美國 Sigma公司;胎牛血清、馬血清由Hyclone公司生產;谷氨酰胺、胰蛋白酶購自華美生物工程公司;DMEM/F12培養基、B27由美國 Gibco公司生產;SP免疫組化染色試劑盒購自北京中杉金橋公司;黃芪注射液由成都地奧九泓制藥廠生產;其他試劑為國產分析純。主要儀器:HERA cell 150型 CO2培養箱由德國 Heraeus公司;LEICA DMIL 090-135.001型倒置顯微鏡由德國 Wetzlar GmbH公司;TDL-40B離心機由上海安亭科學儀器制造廠生產。

1.3 海馬神經元的培養 取新生 24 h的乳鼠放進冰浴的75%酒精內浸泡 1 min消毒并窒息,用眼科顯微鑷夾取海馬組織,在解剖顯微鏡下去除含有血管的軟腦膜(以上操作均在冰上進行),沉淀后吸去上層 D-Hanks液,放入 0.125%胰蛋白酶消化 10～15 min,同時用眼科剪剪切海馬組織到 1 mm3大小,用馬血清終止消化,把組織塊混合液移入離心管,1 000 r/min離心 5 min,離心 3次,去上清后加 DMEM/F12溶液 5 ml,吹打離散組織,制成細胞懸液,200目濾網過濾。取 10μl細胞懸液苔盤藍染色計算活細胞數,接種在直徑為 22 mm培養皿中,用于細胞免疫化學。

1.4 缺氧缺糖/復氧復糖細胞模型的建立與實驗分組 把原代培養 8d的大鼠海馬神經元隨機分為正常對照組、模型組、黃芪注射液組和黃芪注射液溶劑對照組。除正常對照組外均參照 Bossenmeyer〔2〕等的方法建立缺氧缺糖/復氧復糖細胞模型:用無糖 Earle液代替培養液,隨即把培養皿(瓶)置于 37℃CO2溫箱中的缺氧裝置里,快速通入高純氮氣 5 min,再使氣體勻速緩慢連續排出。缺氧缺糖 30 min后,換正常無血清培養液繼續在 37℃,5%CO2培養箱內培養。黃芪注射液組于缺氧缺糖時加入黃芪注射液 0.5g(生藥)/L〔1〕,直至培養結束;黃芪注射液溶劑對照組處理方法與黃芪注射液組相同,只是將黃芪注射液換為 pH7.4的等量黃芪注射液溶劑即無菌去離子水;模型組在缺氧缺糖時加入與正常培養液等量的 Earle′s液,缺氧缺糖后正常培養。各組在復氧復糖后 0、0.5、2、6、24、72和 120 h觀察bcl-2、bax、cyt-c蛋白形態學表達變化。

1.5 免疫細胞化學檢測海馬神經元純度鑒定及 bcl-2、bax、cytc蛋白表達 采用 SP法檢測 NSE、bcl-2、bax及 cyt-c,具體操作均按試劑盒說明書進行。兔抗大鼠NSE多克隆抗體按 1:50稀釋,兔抗大鼠 bcl-2多克隆抗體按 1∶1 500稀釋、小鼠抗大鼠 bax單克隆抗體按 1∶300稀釋、小鼠抗大鼠 cyt-c單克隆抗體按 1∶400稀釋;PBS代替一抗作陰性對照。陽性細胞胞漿和突起呈棕黃色,胞核有少許黃色顆粒。采用 MiVnt圖像分析系統對免疫組化陽性結果進行半定量分析。

2 結 果

2.1 海馬神經元原代培養純度鑒定 免疫組化染色結果顯示:無血清培養 8d的海馬神經元胞體飽滿,突起明顯、突起末端分支形成神經網絡,相互支持生長,神經膠質細胞少見,5個400倍視野中陽性神經細胞的數目為 72個,純度為(91.48±0.72)%,見圖 1。

2.2 細胞免疫化學檢測海馬神經元 bcl-2、bax、cyt-c蛋白表達免疫組化染色結果顯示:與正常對照組比,模型組除0h外其余各時間點 bcl-2、bax、cyt-c蛋白表達明顯增高,而 bcl-2/bax比值降低(P＜0.05);與模型組比,黃芪注射液組除 0 h外其余各時間點 bcl-2蛋白表達及 bcl-2/bax比值增高、而 bax、cyt-c蛋白表達顯著降低(P＜0.05),而黃芪注射液溶劑對照組無明顯差異(P＞0.05),bcl-2蛋白在 0.5 h有表達,2 h達高峰。bax和cyt-c蛋白在 0.5h有表達,6 h達高峰。見表 1。

圖1 NSE蛋白的表達(×400)

表1 黃芪注射液對缺氧缺糖 /復氧復糖大鼠海馬神經細胞 bcl-2、bax、bcl-2/bax表達的影響(±s,n=5)

表1 黃芪注射液對缺氧缺糖 /復氧復糖大鼠海馬神經細胞 bcl-2、bax、bcl-2/bax表達的影響(±s,n=5)

與正常對照組比較:1)P＜0.05;與模型組、溶劑對照組比較:2)P＜0.05

組別bcl-2 0 h 0.5 h 2 h 6 h 24 h 72 h 120 h正常對照組 0.368±0.04 0.352±0.04 0.371±0.02 0.366±0.05 0.370±0.03 0.358±0.04 0.349±0.02溶劑對照組 0.365±0.02 0.533±0.041) 0.625±0.041) 0.572±0.021) 0.543±0.041) 0.475±0.031) 0.386±0.041)模型組 0.370±0.03 0.536±0.041) 0.630±0.021) 0.583±0.031) 0.539±0.021) 0.486±0.051) 0.404±0.031)黃芪注射液組 0.369±0.03 0.573±0.022) 0.681±0.032) 0.631±0.052) 0.571±0.012) 0.521±0.022) 0.395±0.032)組別 bax 0 h 0.5 h 2 h 6 h 24 h 72 h 120 h正常對照組 0.433±0.04 0.413±0.04 0.452±0.02 0.422±0.05 0.448±0.03 0.437±0.06 0.408 ±0.03溶劑對照組 0.432±0.05 0.728±0.061) 0.875±0.041) 0.972±0.031) 0.810±0.021) 0.639±0.051) 0.521 ±0.041)模型組 0.430±0.06 0.730±0.041) 0.880±0.031) 0.965±0.021) 0.795±0.051) 0.644±0.061) 0.514±0.021)黃芪注射液組 0.429±0.03 0.655±0.042) 0.735±0.032) 0.802±0.042) 0.693±0.032) 0.576±0.042) 0.468±0.052)組別 bcl-2/bax 0 h 0.5 h 2 h 6 h 24 h 72 h 120 h正常對照組 0.850±0.028 0.852±0.023 0.851±0.022 0.851±0.019 0.852±0.030 0.855±0.020 0.855±0.030溶劑對照組 0.844±0.023 0.728±0.0211) 0.710±0.0241) 0.591±0.0301) 0.670±0.0201) 0.739±0.0181) 0.771±0.0261)模型組 0.858±0.021 0.730±0.0251) 0.692±0.0201) 0.611±0.0201) 0.673±0.0231) 0.744±0.0251) 0.786±0.0211)黃芪注射液組 0.852±0.025 0.814±0.0192) 0.799±0.0282) 0.758±0.0212) 0.788±0.0302) 0.803±0.0222) 0.812±0.0272)

3 討 論

腦血管病是神經系統常見病、多發病、其致死率、致殘率均高,缺血造成了腦組織的損傷,腦缺血后的再灌注損傷是缺血性腦血管病發病的重要病理生理環節,主要通過誘導細胞凋亡導致神經元死亡〔3〕。缺氧缺糖/復氧復糖所致的神經細胞損傷是腦缺血/再灌注損傷主要表現形式之一。研究表明,線粒體在真核細胞凋亡過程中起著樞紐作用,線粒體通路在神經細胞凋亡控制中發揮決定性作用〔4〕。

線粒體是有氧呼吸產生能量的主要場所,在細胞凋亡過程中起最基本的作用,其關鍵性分子是cyt-c,而主要的信號轉導通路是 JNK信號轉導通路,其中JNK3的表達與神經元凋亡關系十分密切,葉冬青〔5〕等研究表明,缺氧缺糖/復氧復糖可通過增加 JNK3表達而誘發神經元凋亡。正常情況下cyt-c是一個定位于線粒體膜間隙的水溶性蛋白,穩定地結合于線粒體內膜,參與呼吸鏈上的電子傳遞。在缺血缺氧時,線粒體膜通透性增加,大量cyt-c蛋白釋放入細胞胞質,阻斷呼吸鏈電子傳遞,細胞能量供應減少,最終導致細胞凋亡。cyt-c釋放的具體機制有兩種途徑:①線粒體外膜蛋白聚合成膜通透轉運孔PTP復合體,是一種高電導非選擇性通道〔6〕。外界刺激使 PTP開放和線粒體膜電位崩解,水分進入導致線粒體外膜斷裂cyt-c和凋亡介導因子(AIF)釋放。②Bcl-2基因蛋白家族形成的通道〔7〕。Bcl-2家族成員通過調節線粒體外膜的通透性和完整性起重要調控作用,Bcl-2家族可以分為兩類:一類是抗細胞凋亡基因,其代表是 Bcl-2基因;另一類是促細胞凋亡基因,其代表是 bax基因。Bcl-2/Bax鑲嵌在線粒體膜上,調控凋亡誘導蛋白的釋放和線粒體功能,兩者間的平衡影響凋亡的發生〔8〕。線粒體外膜上的Bax能允許 cyt-c穿過線粒體膜,進入細胞質,從而引起細胞凋亡,而Bcl-2的作用正好相反,它能封閉 Bax形成孔道的活性,使一些小分子不能自由通透,從而保護細胞免于凋亡。進入胞質的 cyt-c與凋亡酶激活因子-1(APAF-1)結合并將其激活,然后又結合輔助因子 dATP/ATPAPA構成凋亡小體,其中的APAF-1招募 procaspase-9在凋亡小體上寡聚,procaspase-9發生同源活化〔9〕,其進一步激活下游的效應胱天蛋白酶 caspase-3,進而活化 caspase-6、7促細胞走向凋亡〔10〕。他們通過激活一系列下游基因發揮調節凋亡作用。

此外,有研究表明,Bcl-2是抗凋亡基因,而 Bax是促凋亡基因,二者的比例是決定細胞是否發生凋亡的重要調控因素〔11〕。在細胞中 Bcl-2蛋白和Bax蛋白是以異二聚體的形式存在,阻止 Bax插入線粒體外膜,保護線粒體電勢梯度,調節細胞內Ca2+的自穩狀態和氧化還原狀態來抑制凋亡。如果 Bcl-2和Bax的表達量相互平衡,形成的 Bcl-2/Bax異二聚體占優勢,則細胞的存活期正常;如果 Bcl-2過表達而 Bax的表達不相應增多,使形成的Bcl-2/Bcl-2同二聚體占優勢,則細胞的存活期延長;如 bax過表達而 Bcl-2不相應增多,使形成的 Bax/Bax同二聚體占優勢,則發生細胞凋亡〔12〕。

現代藥理學研究表明,黃芪所含的黃芪皂甙類和黃芪多糖具有擴張血管、清除體內氧自由基、減少血栓形成、改善腦血流、降低血脂、改善微循環等多重作用〔13〕。黃芪注射液為中藥黃芪提取物制成的針劑,具有益氣養元、扶正祛邪、通脈養心、健脾利濕的作用。黃芪注射液每 1 ml相當于生藥 2 g,張雅麗等〔1〕研究證實黃芪注射液可提高海馬神經細胞活性,抑制缺氧缺糖后復氧復糖大鼠海馬神經細胞的凋亡。

本實驗以大鼠海馬神經元原代培養為基礎,通過對培養細胞施加缺氧缺糖/復氧復糖因素來模擬腦缺血/再灌注病理生理過程,海馬神經元在缺氧缺糖后復氧復糖 0 h細胞凋亡信號轉導通路還未啟動,故各組 bcl-2、bax及 cyt-c蛋白表達比較無明顯差異。復氧復糖 0.5 h隨細胞凋亡信號的啟動 bcl-2、bax及cyt-c蛋白表達開始升高。隨著復氧復糖時間延長,發揮進一步凋亡信號傳遞過程,模型組 bcl-2、bax及 cyt-c蛋白表達進一步增高,其中 bcl-2蛋白表達 2 h達高峰、bax及 cyt-c蛋白表達 6 h達高峰,復氧復糖 24、72、120 h表達逐漸降低但仍顯著高于正常組。黃芪注射液可顯著降低缺氧缺糖/復氧復糖后除 0 h外各時間點 cyt-c、bax蛋白的表達,使 bcl-2蛋白表達升高。本實驗顯示,黃芪注射液可通過抑制 bax蛋白的表達,提高bcl-2蛋白活性,從而抑制 cyt-c蛋白釋放入胞漿,發揮抗神經細胞凋亡的作用。

1 張雅麗,高維娟,閆鳳霞,等 .黃芪注射液抑制缺氧缺糖后復氧復糖大鼠海馬神經細胞凋亡的研究〔J〕.中國老年學雜志,2009;29(7):793-6.

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5 葉冬青,高維娟,錢 濤,等 .黃芪注射液抑制缺氧缺糖/復氧復糖大鼠海馬神經元 JNK3的表達〔J〕.中國藥理學通報,2010;26(1):77-82.

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7 Zhang H,Li Q,Li Z,et al.The protection of Bcl-2 overexpression on rat cortical neuronal injury caused by analogousischemia/reperfusion in vitro〔J〕.Neurosci Res,2008;62(2):140-6.

8 Burguillos MA,Hajji N,Englund E,et al.Apoptosis-inducing factor mediates dopaminergic cell death in response to LPS-induced inflammatory stimulus Evidence in Parkinson′s disease patients〔J〕.Neurobiol Dis,2010;9(17):1-12.

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10 Tang W,Wang W,Zhang Y,et al.Tumour necrosisfactor-related apoptosis-inducing ligand(TRAIL)-induced chemokine release in both TRAIL-resistant and TRAIL-sensitive cells via nuclear factor kappa B〔J〕.FEBS,2009;276(2):581-93.

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13 Iijima T,Mishima T,Akagawa K,et al.Neuroprotective effect of propofol on necrosis and apoptosis following oxygen-glucose deprivation-relationship between mitochondrial membrane potential and mode of death〔J〕.Brain Res,2006;1099(1):25-32.