辛伐他汀對銅和高膽固醇阿爾茨海默病家兔海馬淀粉樣肽前蛋白 mRNA表達的影響

張瑞峰 馬東明 姜希娟 盧 斌 蘇金玲 郭茂娟

(天津中醫(yī)藥大學病理教研室,實驗教學部,天津 300193)

近年逐漸認識到膽固醇是引起阿爾茨海默病(AD)發(fā)病的一個確定的危險因素,高膽固醇人群中,AD的發(fā)生率增高〔1〕。Mori等發(fā)現(xiàn)無論是AD病人腦內(nèi)還是淀粉樣肽前蛋白(APP)轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)均在老年斑的高密度核區(qū)有膽固醇沉積〔2〕。研究還發(fā)現(xiàn),腦內(nèi)銅的代謝水平與 AD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),AD患者腦內(nèi)老年斑塊中心及周圍銅的水平明顯高于正常大腦組織的生理水平〔3〕。Sparks發(fā)現(xiàn)高膽固醇飲食家兔在飲用添加微量銅離子的蒸餾水時,AD的形態(tài)和病理表現(xiàn)更突出〔4〕。他汀類藥物在降低血清膽固醇的同時,能使 AD的患病率降低 60% ～70%〔5〕。本研究就他汀類降低 AD發(fā)病的潛在機制進行研究。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 辛伐他汀(商品名:賽夫丁),南通華山藥業(yè)有限公司,批號:081202。膽固醇,分析純,天津市英博生化試劑有限公司,批號:090423;Trizol·Reagent(Invitrogen,Carlsbad,CA)試劑盒、Oligod(T)16,High capacity cDNA Reverse Transcription Kit試劑盒 (Applied Biosystems、P/N:4368814),Power SYBR·Green PCR Master Mix試劑盒(Applied Biosystems、P/N:4367659)、PCR引物(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司提供)。標準膽固醇(HPLC級)為美國 Sigma公司產(chǎn)品,色譜純級乙腈、異丙醇、無水乙醇等。

1.2 主要儀器 HYBAIDPE 480反轉(zhuǎn)錄儀,ABI7300實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)儀,VAR IAN Prostar 210高效液相色譜儀(美國 VAR IAN公司生產(chǎn)),配置 Prostar 210高壓泵、VAR IANProstar 500柱溫箱、手動進樣器,超速低溫離心機,微量組織勻漿器,0.45μm的微孔濾器等。

1.3 方法

1.3.1 實驗動物模型的建立與分組 健康成年雄性新西蘭大白兔(軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供)27只,體質(zhì)量(2 356±212)g,在溫度(28±2)℃,濕度 37% ～48%,12h交替照明的清潔環(huán)境中給予普通飼料和自來水適應(yīng)喂養(yǎng) 2w后,隨機取出 9只作為對照組,采用普通飼料和蒸餾水喂養(yǎng),直至實驗結(jié)束,共 9w。其余家兔參照 Sparks等〔4〕的方法給予 2%高膽固醇飼料和含 0.12×10-6銅離子(以硫酸銅的形式)的蒸餾水造模。6 w后,造模家兔死亡 1只,將造模成功家兔隨機分為模型組(由于停用膽固醇后,家兔血清膽固醇水平會很快降低,因此,6 w后繼續(xù)給予高膽固醇飼養(yǎng) 3 w,n=9)和辛伐他汀組〔辛伐他汀(5mg?kg-1?d-1)灌胃 3 w,其余處理同模型組,n=8〕。上述給藥劑量為“按照成人體表面積折算的等效劑量”。

1.3.2 標本獲取與處理 戊巴比妥鈉(25 mg/kg)靜脈麻醉后,開顱于一側(cè)海馬相同位置取 100 mg大小的組織塊,液氮保存?zhèn)銻T-PCR用。另取少量海馬組織稱重后按 10 ml/g加無水乙醇在冰臺上磨成勻漿,在 20 600 r/min,4℃離心 2次,每次20 min,將上清液以 0.45μm的微孔濾膜濾過,取濾液分裝,-70℃保存留測海馬膽固醇。

1.3.3 檢測項目 高效液相色譜法(HPLC)測定海馬膽固醇含量。RT-PCR法測定海馬APP mRNA表達。用Trizol試劑盒抽提海馬組織總 RNA,采用紫外分光光度計定量并檢測 RNA純度。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒要求將總 RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。特異性引物序列見下表,由上海生工生物工程技術(shù)公司合成。GAPDH,正義鏈:5'TCTCTCAAgATTgTCAgCAACg3',反義鏈:5'CTTCACAAAgTggTCATTgAgg3';APP,正義鏈:5'TCTACCCTgAACTg-CAg3',反義鏈 :5'CTgCATgTCTCTTTggC3'。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行分析,數(shù)據(jù)以±s表示,組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用 LSD法;相關(guān)性分析采用 Pearson法。

2 結(jié) 果

模型組海馬膽固醇含量及APP mRNA表達水平顯著高于正常組 (P＜0.05)。辛伐他汀組海馬膽固醇含量及 APP mRNA表達水平顯著低于模型組 (P＜0.05);與正常組相比,無顯著性差別 (P＞0.05)。相關(guān)性分析顯示,海馬 APP mRNA表達水平與海馬膽固醇含量呈正相關(guān) (r=0.058,P＜0.05)。見表 1。

表1 辛伐他汀對海馬膽固醇以及海馬APPm RNA表達的影響(±s)

表1 辛伐他汀對海馬膽固醇以及海馬APPm RNA表達的影響(±s)

與模型組相比:1)P＜0.05

組別 n APP 海馬膽固醇(mg/g)正常組 9 0.22±0.061) 1.39±0.111)模型組 9 0.47±0.12 1.51±0.07辛伐他汀組 8 0.29±0.051) 1.31±0.131)

3 討 論

APP是廣泛存在于全身組織細胞的跨膜糖蛋白。體內(nèi)APP代謝途徑主要有二:①結(jié)構(gòu)性分泌途徑即由α分泌酶水解產(chǎn)生 αAPPs②淀粉樣肽源途徑,即先后經(jīng)產(chǎn)生 β-,γ-分泌酶水解產(chǎn)生 39-43個氨基酸的有神經(jīng)毒性的多肽,即 Aβ。本文結(jié)果顯示海馬 APP的表達與海馬膽固醇含量呈正相關(guān)。Frears的研究認為膽固醇負荷增強了細胞膜APP產(chǎn)生過程〔6〕。與本實驗結(jié)果一致。APP和 Aβ易出現(xiàn)在生物膜上膽固醇豐富區(qū)(CRDs)。機制可能是,膽固醇通過直接影響APP的代謝而促進 Aβ生成。APP代謝途徑的兩個關(guān)鍵酶:γ和 β分泌酶的功能依賴于細胞膜的脂筏結(jié)構(gòu)。脂筏是指那些富含膽固醇和鞘糖脂的膜區(qū)域,是許多蛋白質(zhì)系統(tǒng)的信號平臺。已經(jīng)有足夠的證據(jù)表明,高膽固醇含量的脂筏環(huán)境,可通過對 β分泌酶糖基磷酸化而顯著提升其活性。膽固醇還引起 APP的β切割位點的變化,并使其處于合適的反應(yīng)構(gòu)象,從而促進了APP的淀粉樣代謝途徑,產(chǎn)生更多的Aβ。也有研究認為,膽固醇失衡促進β分泌酶抑制 α分泌酶對APP的裂解作用,促進了Aβ產(chǎn)生,進而也增加了 Aβ的聚集〔7〕。辛伐他汀降低 AD發(fā)病,可能一方面通過在轉(zhuǎn)錄水平上減少APP的生成,一方面通過降低腦內(nèi)膽固醇含量影響脂筏形成而減少APP生成Aβ的量。

1 Kivipelto M,Helkala EL,Laakso MP,et al.Midlife vascular risk factors and Alzheimer's disease in later life:longitudinal,population based study〔J〕.BMJ,2001;322(7300):1447-51.

2 Mori T,Paris D,Town T,et al.Cholesterol accumulates in senile plaques of Alzheimer′s disease patients and in transgenic APP(SW)mice〔J〕.J Neuropathol Exp Neurol,2001;60(8):778-85.

3 Lovell MA,Robertson JD,Teesdale WJ,et al.Copper iron and zinc in Alzheimer's disease senile plaques〔J〕.J Neurol Sci,1998;158(1):47-52.

4 Sparks DL,Schreurs BG.Trace amounts of copper in water induce betaamyloid plaques and learning deficits in arabbit model of Alzheimer's disease〔J〕.Proc Natl Acad Sci U SA,2003;100(19):11065-9.

5 Wolozin B,Kellman W,Ruosseau P,et al.Decreased prevalence of Alzheimer disease associated with 3-hydroxy-3-methyglutaryl coenzyme a reductase inhibitors〔J〕.Arch Neurol,2000;57(10):1439-43.

6 Frears ER,Stephens DJ,Walters CE,et al.The role of cholesterol in the biosynthesis of beta-amyloid〔J〕.Neuroreport,1999;10(8):1699-705.

7 郝俊巍,李 林.膽固醇代謝異常與阿爾茨海默病〔J〕.生理科學進展,2005;36(1):64-7.