補腎中藥對帕金森病模型小鼠黑質-紋狀體神經元的保護作用

田 允 蔡 晶 陳旭征 林如輝 劉志臻 趙錦燕

(福建中醫(yī)藥大學 福建中西醫(yī)結合研究院,福建 福州 350108)

帕金森病(PD)是常見于中老年人的神經退行性疾病,隨著人口的老齡化,本病的發(fā)病率正在逐年遞增,嚴重影響患者的生活質量。中醫(yī)理論有腎主骨生髓,腦為髓之海之說,因此可以通過滋補腎臟來補益腦髓。現(xiàn)代研究也表明以補腎為主的方藥可延緩 PD過程,改善 PD患者的生活質量。本實驗通過對 PD模型小鼠神經凋亡因子和神經營養(yǎng)因子(NTFs)的檢測來探討補腎中藥治療PD的可能途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 7周齡 SPF級C57BL/6J品系雄性小鼠 90只,購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司〔合格證號:SCXK(瀘)2007-0005〕,體重(20±2)g。置于福建中醫(yī)藥研究院實驗動物中心 SPF級動物飼養(yǎng)室飼養(yǎng)并建造模型,室溫 20～22℃。小鼠全價顆粒飼料由福建中醫(yī)藥研究院實驗動物中心提供。

1.1.2 藥品、試劑 淫羊藿,小檗科箭葉淫羊藿 Epimedium sagittatum Maxim.的地上部分,產地四川;女貞子,木犀科女貞Ligustrum lucidum Ait.的干燥成熟果實,產地浙江;黃精,百合科多年生草本植物黃精 Polygonatum sibiricum Red.的根莖,產地河北;司來吉蘭,南京思科藥業(yè)有限公司生產,5 mg×10。以上藥品均由福建醫(yī)藥集團提供。淫羊藿、女貞子、黃精經福建中醫(yī)學院藥學系楊成梓副教授鑒定,并經福建中醫(yī)學院中藥生藥學實驗室測定 1-甲基-4苯基-1,2,3,6-四氫吡啶鹽酸鹽(MPTP?HCl),訂購于西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司;FasL抗體、FasL抗體同型對照、Fas抗體、Fas抗體同型對照、Caspase-3抗體、Caspase-3抗體同型對照及 Bcl-2試劑盒均由美國 BD公提供;小鼠神經生長因子(NGF)、腦源性神經營養(yǎng)因子(BDNF)、膠質源細胞性神經營養(yǎng)因子(GDNF)的 ELISA試劑盒均由上海西唐生物科技有限公司提供。

1.1.3 主要實驗儀器 多功能小鼠自主活動記錄儀(YLS-1A,淮北正華)、小鼠轉棒疲勞儀(YLS-4C,淮北正華)、透射電鏡(H7650,日本日立公司)、流式細胞儀(Facscalibur,美國 BD公司)、全自動酶標儀(XL800,美國 Bioteck公司)。

1.2 方法

1.2.1 PD模型的制備、小鼠分組及給藥 C57BL/6J品系雄性小鼠腹腔注射 MPTP? HCl,25 mg?-1kg? d-1〔1～3〕,隔日 1次,連續(xù) 18次。每次注射后至少 4h后檢測小鼠的自主活動次數(shù)和轉棒時間,最后一次檢測后統(tǒng)計分析小鼠的活動情況,選自主活動次數(shù)和轉棒時間均下降小鼠為造模成功小鼠。取正常 11周齡SPF級 C57BL/6J品系雄性小鼠 8只作為正常對照組,取 40只造模成功的小鼠隨機分為淫羊藿組、女貞子組、黃精組、司來吉蘭組及模型組 5組,每組 8只。淫羊藿組、女貞子組、黃精組、司來吉蘭組分別灌胃給予淫羊藿、女貞子、黃精、司來吉蘭的水煎液及水溶液,正常對照組及模型組均給予蒸餾水。每次灌胃 0.5 ml,2次/d,連續(xù)給藥 4 w,每日給藥時間為8:00和 16:00。淫羊藿、女貞子、黃精、司來吉蘭劑量分別為 6、6、8、2mg? kg-1? d-1,相當于成人常用量。

1.2.2 藥物制備 分別稱淫羊藿 36 g、女貞子 36 g、黃精48g加入 600 ml的蒸餾水中,浸泡 60 min后,煎煮 300 ml藥液,藥液濃度分別為 120、120、160 mg/ml,過濾后裝瓶密封消毒,4℃冷藏備用。司來吉蘭 12mg,用雙蒸水溶解配制成 300 ml的水溶液,藥液濃度為 0.04 mg/ml,裝瓶密封消毒,4℃冷藏備用。

1.2.3 標本采集及觀察項目 給藥后小鼠每組取 7只快速脫頸椎處死,用眼科剪開顱迅速取腦。生理鹽水沖洗去除大腦皮層表面的脂肪組織。在冰浴中切取黑質-紋狀體。小鼠右側的黑質-紋狀體用眼科剪剪成糊狀加磷酸鹽緩沖液(PBS),以 200目的尼龍網濾成單細胞液體,離心去上清,加PBS混勻并調整細胞濃度為 1×106/ml單細胞懸液流式檢測 FasL、Fas、Caspase-3、Bcl-2;左側黑質-紋狀體 0.1 g組織加入生理鹽水 1 ml的比例勻漿取上清 ELISA法檢測 NGF、BDNF、GDNF。每組 1只小鼠快速脫頸椎處死,用眼科剪開顱迅速取腦。生理鹽水沖洗去除大腦皮層表面的脂肪組織。在冰浴中切取黑質,置于電鏡固定液中送檢。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件,檢測結果用±s表示,用藥后組間數(shù)值比較,采用完全隨機設計的單因素方差分析,組間差異的多重分析用LSD或 Games-Howell法。

2 結 果

2.1 各組小鼠用藥后 FasL、Fas、Caspase-3、 Bcl-2含量比較結果 淫羊藿組和女貞子組FasL的含量與正常對照組、司來吉蘭組及模型組無明顯差異 (P＞0.05);黃精組FasL的含量明顯低于模型組 (P＜0.05),與司來吉蘭組及空白對照組無明顯差異 (P＞0.05)。淫羊藿組、女貞子組和黃精組的 Fas的含量與空白對照組、司來吉蘭組及模型組無明顯差異 (P＞0.05)。淫羊藿組、女貞子組及黃精組的 Caspase-3的含量均低于模型組 (P＜0.05),均與正常對照組和司來吉蘭組無明顯差異 (P＞0.05)。淫羊藿組、女貞子組和黃精組 Bcl-2含量均與正常對照組、司來吉蘭組及模型組沒有顯著差異 (P＞0.05)。見表 1。

表1 各組小鼠用藥后神經相關凋亡因子的水平(±s)

表1 各組小鼠用藥后神經相關凋亡因子的水平(±s)

與模型組比較:1)P＜0.05

組別 n FasL n Fas Caspase-3 Bcl-2正常對照組 6 4.968±2.934 7 1.733±0.813 1.510±0.317 1.844±0.522淫羊藿組 6 4.475±2.665 7 1.541±0.312 2.490±1.5481) 2.156±0.505女貞子組 6 5.302±2.644 7 2.275±1.767 2.015±0.5611) 2.397±1.869黃精組 6 2.465±2.0451) 7 1.523±0.643 2.191±0.4051) 1.300±0.679司來吉蘭組 6 4.170±4.3221) 7 0.930±0.598 2.139±0.6381) 2.156±0.711模型組 6 6.473±1.426 7 1.917±1.359 3.872±0.448 1.567±0.325

2.2 各組小鼠用藥后NGF、BDNF、GDNF含量比較結果 黃精組中 NGF的含量明顯高于模型組、司來吉蘭組(P＜0.05),與正常對照組無明顯差異(P＞0.05);淫羊藿組和女貞子組中NGF的含量與模型組和司來吉蘭組均無明顯差異(P＞0.05)。淫羊藿組和黃精組中的BDNF的含量均高于模型組和空白對照組(P＜0.05),淫羊藿組與司來吉蘭組無明顯差異(P＞0.05),黃精組明顯高于司來吉蘭組(P＜0.05);女貞子組中BDNF的含量與正常對照組、司來吉蘭組和模型對照組均無明顯差異(P＞0.05)。淫羊藿子、女貞子組和黃精組中 GDNF的含量與空白對照組、司來吉蘭組和模型組均無差異(P＞0.05)。見表 2。

表2 各組小鼠用藥后神經相關保護因子的OD值(±s)

表2 各組小鼠用藥后神經相關保護因子的OD值(±s)

與正常對照組比較:1)P＜0.05;與模型組比較:2)P＜0.05;與司來吉蘭組比較:3)P＜0.05

組別 n NGF BDNF n GDNF正常對照組 7 0.213±0.081 0.251±0.027 6 0.125±0.011淫羊藿組 7 0.162±0.142 0.334±0.0862)3)6 0.121±0.013女貞子組 6 0.170±0.011 0.291±0.060 6 0.117±0.015黃精組 6 0.204±0.0482)3)0.375±0.1861)2)3)7 0.137±0.007司來吉蘭組 7 0.178±0.0391) 0.297±0.100 7 0.135±0.025模型組 6 0.176±0.0121) 0.245±0.013 6 0.122±0.027

2.3 各組小鼠用藥后黑質神經元的形態(tài)變化 正常對照組小鼠黑質神經元電鏡下觀察到胞膜和細胞器完整,線粒體、高爾基復合體豐富,有少量溶酶體,染色質散在于核的中部,著色淺;模型組小鼠黑質神經元在電鏡下則觀察到胞體縮小,核漿比例縮小,胞核固縮,染色質邊集,內質網擴張呈空泡狀等凋亡表現(xiàn);淫羊藿組、女貞子組及黃精組小鼠黑質神經元核內胞核固縮及染色質邊聚表現(xiàn)較模型組有減輕,內質網擴張狀態(tài)不明顯,溶酶體含量較多。見圖 1。

圖1 各組模型小鼠用藥后黑質神經元電鏡圖片(×8 000)

3 討 論

PD的主要病理改變?yōu)橹心X黑質致密帶多巴胺能神經元的變性、丟失。大量的研究表明凋亡參與了 PD多巴胺能神經元的變性、缺失。PD患者DA能神經元的凋亡除了有形態(tài)學上的改變,還有研究證明凋亡因子也參與了多巴胺神經元的變性、缺失,在 PD患者活檢的黑質組織中發(fā)現(xiàn)激活的 Caspase-1、3、8、9等的比例高于正常對照組,相關凋亡因子 P53、CD95、Bax-XL的表達也增高。此外在 MPTP誘導的PD小鼠模型中也發(fā)現(xiàn)CJun、BaxmRNA的表達上調,而凋亡抑制因子 Bcl-2的表達下調〔2～5〕。而且細胞凋亡主要是通過 Caspases家族降解底物蛋白誘導的,因此,阻斷 Caspase的激活成為治療 PD,阻止其病情發(fā)展的重要途徑。有研究表明補肝腎、補脾腎的單味藥及方劑都可以上調實驗動物腦中 Bcl-2的表達、降低 Caspase-3、Fas及FasL的表達,從而減少神經元的凋亡〔6～9〕。 本實驗中淫羊藿、女貞子可以降低PD模型小鼠腦黑質-紋狀體中 Caspase-3的含量;黃精可以降低 PD模型小鼠腦黑質-紋狀體中 Caspase-3、FasL的含量;淫羊藿、女貞子和黃精對抗凋亡因子Bcl-2均沒有明顯的作用。與以往補益中藥可以下調模型動物 Caspase-3、FasL的的含量一致。

NTFs是一類由神經元、神經支配的靶組織或膠質細胞產生并分泌的小分子多肽或蛋白質,它們通過與其相應受體結合而啟動效應神經元存活、生長、分化,在神經系統(tǒng)的發(fā)育和生理功能維持中起著重要作用。其中NGF、BDNF、GDNF在中腦能促進多巴胺能神經元發(fā)育、分化和存活并在多巴胺神經元神經損傷后再修復過程中發(fā)揮重要作用〔10～11〕,是治療 PD最具潛力且副作用較小的治療藥物,但 NGF、BDNF、GDNF作為蛋白大分子,難以通過血腦屏障,使其臨床應用受到限制。如何促進內源性的 NTFs的釋放,已成為治療神經退行性病變的新的研究途徑?，F(xiàn)代臨床研究也表明培補肝腎類方藥對改善 PD的癥狀具有良好的療效〔12〕。本實驗中淫羊藿可以升高 PD模型小鼠腦黑質-紋狀體中BDNF的內源性含量;黃精也可以增加 PD模型小鼠腦黑質-紋狀體中 BDNF、NGF的內源性含量,黃精上調BDNF的程度可以使腦內 BDNF的含量超過正常水平;女貞子則對PD模型小鼠腦黑質-紋狀體中內源性 NTFs沒有明顯作用。補腎方藥對PD患者的療效可能是通過提高腦內 NTFs的含量起作用的。

PD主要表現(xiàn)為肢體活動失調,且發(fā)病年齡在進入腎氣衰退的中老年時期,故腎虛髓空是導致PD發(fā)生的內在條件,補腎益髓是治療PD的重要方法。本實驗證實補腎中藥可能通過降低黑質-紋狀體中相關凋亡因子的含量、增加NTFs的含量來改善DA能神經元的凋亡,從而達到改善 PD臨床癥狀、延緩PD進展的療效的。

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