小鼠全腦缺血再灌注模型的制備及評(píng)價(jià)

陳遠(yuǎn)壽 陳 旻 張 弛 (遵義醫(yī)學(xué)院生理教研室,貴州 遵義 563003)

腦血管疾病是嚴(yán)重危害人類健康的三大疾病之一,具有高發(fā)病率、高致殘率和高死亡率的特點(diǎn),是中老年人致死和致殘的主要疾病〔1〕。由于小鼠體重差異小,其腦缺血更接近于人類腦供血不足或腦梗死再灌時(shí)腦組織病理生理演變過程〔2〕,故小鼠腦缺血模型是研究腦梗死后神經(jīng)細(xì)胞死亡、神經(jīng)功能修復(fù)及藥物保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。并且轉(zhuǎn)基因小鼠目前在腦缺血研究中的作用日趨重要,因此建立一種穩(wěn)定的小鼠腦缺血再灌注模型極其重要。為此,本文以C57BL/6小鼠為研究對(duì)象,采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈和基底動(dòng)脈三血管阻塞的方法制備全腦缺血模型,觀察不同缺血時(shí)間和不同再灌注時(shí)間對(duì)小鼠腦損傷的影響,以探討該模型的制備及評(píng)價(jià)方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及其分組 84只雄性 C57BL/6小鼠,體重 20～25 g(由中國科學(xué)院上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供),隨機(jī)分為假手術(shù)對(duì)照組(sham組)和腦缺血/再灌注組(I/R組),缺血時(shí)間分為 8、12、16min三個(gè)時(shí)間組(再灌注 3 d),缺血 12 min后再灌注分為 6 h、3、7、28d四個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀察。

1.2 小鼠全腦缺血/再灌注模型的制作 采用三血管(兩側(cè)頸總動(dòng)脈 +基底動(dòng)脈)阻塞法(3-VO)。小鼠稱重后用 10%水合氯醛(300 mg/kg),腹腔注射(i.p.)麻醉,再給阿托品(0.25 mg/kg,i.p.)。將小鼠固定于自制的墊有發(fā)熱毯的小鼠固定板上,用直腸體溫計(jì)監(jiān)測(cè)小鼠體溫并維持在 37℃左右,頸部正中切口約 2～3cm,在解剖顯微鏡下分離出兩側(cè)頸總動(dòng)脈并穿線備用,從氣管和食管左側(cè)旁向下剝離至寰枕關(guān)節(jié)膜,暴露出硬腦膜和蛛網(wǎng)膜,并用 1 ml注射器針尖將其剝離,切斷蛛網(wǎng)膜骨小梁,暴露并從腦干表面游離出基底動(dòng)脈,然后用微型動(dòng)脈夾(用直徑為 0.2 mm的不銹鋼鋼絲制作而成,日本東京FUJITA醫(yī)療器械有限責(zé)任公司定制)夾閉基底動(dòng)脈,在解剖顯微鏡下可肉眼證實(shí)基底動(dòng)脈血流被阻斷,再用小動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈后開始計(jì)時(shí),造成小鼠全腦缺血到相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)后,松開動(dòng)脈夾恢復(fù)腦血供(在顯微鏡下肉眼證實(shí)),縫合切口后予卡那霉素(20 mg/kg,i.p.),把小鼠放進(jìn) 30℃的恒溫保育箱,進(jìn)行再灌注到相應(yīng)時(shí)間點(diǎn),期間應(yīng)監(jiān)測(cè)小鼠體溫的變化情況。Sham組小鼠進(jìn)行同樣的手術(shù)處理,但不進(jìn)行三血管栓塞。手術(shù)中如果小鼠呼吸障礙,可用小動(dòng)物呼吸機(jī)維持其自主呼吸。

1.3 樣本取材 腦I/R后各時(shí)間點(diǎn)動(dòng)物予10%水合氯醛i.p.麻醉后,用 4℃ 0.9%生理鹽水和 4%多聚甲醛灌注固定,迅速取腦后固定 4 h(4℃),分別置于 15%和 30%蔗糖脫水直至腦組織沉底(4℃)。海馬行冰凍連續(xù)冠狀切片(20μm)(德國萊卡冰凍切片機(jī))。

1.4 Fluoro-Jade B(F-JB)法染色 取冰凍切片,浸入 100%乙醇5 min,70%乙醇2 min,dd H2O 2 min,0.06%KMnO415 min,ddH2O 1 min,避光下 0.000 5%F-JB儲(chǔ)液 20 min(美國 Histo-Chem公司),雙蒸水(ddH2O)1 min×3次室溫干燥,二甲苯透明膠(DPX)封片。熒光顯微鏡(日本Nikon公司)下觀察海馬神經(jīng)元細(xì)胞變性死亡情況。

1.5 尼氏染色 取冰凍切片,浸入 1∶1乙醇和氯仿溶液中30 min,梯度酒精(100%,95%,80%,70%,60%,50%)水化,蒸餾水沖洗后用甲酚紫染液浸染 30 min,蒸餾水洗,用梯度酒精(50%,60%,70%,80%,95%,100%)脫水,二甲苯透明(2×5 min),DPX封片,顯微鏡明場(chǎng)下觀察海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)變化。各組選取切片 8張,在顯微鏡下對(duì)海馬各區(qū)存活神經(jīng)元計(jì)數(shù),并在分化目鏡下測(cè)量海馬相應(yīng)區(qū)域的長度,按平均每0.2 mm2存活神經(jīng)元數(shù)記錄分析。

2 結(jié) 果

2.1 模型制備的難點(diǎn)和成功率 在克服了手術(shù)過程中游離與夾閉基底動(dòng)脈時(shí)導(dǎo)致破裂出血和小鼠呼吸道阻塞引起通氣功能障礙等技術(shù)難點(diǎn)后,最后缺血 12 min再灌注 3d后模型的成功率為 76.5%,但再灌注 28 d后減少到 50.2%;缺血 8min再灌注 3 d后模型的成功率為 88.7%,缺血 16 min再灌注 3 d后模型的成功率為 56.5%。

2.2 不同缺血時(shí)間再灌注 3 d對(duì)海馬神經(jīng)元損傷的影響sham組大鼠海馬神經(jīng)元未見 F-JB陽性細(xì)胞,腦缺血 8 min再灌注 3 d后海馬 CA 1區(qū)神經(jīng)元出現(xiàn)少量 F-JB陽性細(xì)胞,表明CA1區(qū)神經(jīng)元出現(xiàn)遲發(fā)性變性死亡;缺血 12和 16 min后 CA 1區(qū)神經(jīng)元變性死亡增多,定量分析顯示CA1區(qū)神經(jīng)元存活數(shù)量與 sham組比較顯著減少(P＜0.01),同時(shí) CA 3、DG神經(jīng)元存活數(shù)量與 sham組比較也明顯減少(P＜0.01)。見圖 1、圖 2。

圖1 不同缺血時(shí)間再灌注 3d后對(duì)海馬神經(jīng)元損傷情況的染色評(píng)價(jià)

圖2 不同缺血時(shí)間再灌注 3d后海馬各區(qū)神經(jīng)元存活數(shù)量的定量分析

2.3 缺血 12 min后不同的再灌注時(shí)間對(duì)海馬神經(jīng)元損傷的影響 與sham組比較,再灌注 6h后海馬各區(qū)存活的神經(jīng)元數(shù)量無明顯差異,再灌注 3、7、28 d后可見 CA1、CA3、DG區(qū)存活的神經(jīng)元數(shù)量顯著減少(P＜0.01)。見圖 3、圖 4。

圖3 缺血 12min后不同的再灌注時(shí)間點(diǎn)海馬神經(jīng)元的尼式染色

圖4 缺血 12 min后不同的再灌注時(shí)間海馬各區(qū)神經(jīng)元存活數(shù)量的定量分析

2.4 缺血再灌注對(duì)其他腦區(qū)神經(jīng)元損傷的影響 F-JB熒光染色結(jié)果顯示,缺血 12 min再灌注 3 d后,在小鼠大腦皮層、丘腦、紋狀體均可見F-JB熒光染色陽性細(xì)胞,表明這些腦區(qū)有神經(jīng)元死亡。見圖 5。

圖5 全腦缺血引起的小鼠其他腦區(qū)神經(jīng)元損傷(F-JB染色)

3 討 論

短暫性腦缺血再灌注可導(dǎo)致腦易感區(qū)選擇性遲發(fā)性神經(jīng)元損害,以海馬 CA1區(qū)最為敏感〔3,4〕,很多學(xué)者都以海馬 CA1區(qū)神經(jīng)元損傷作為模型,試圖研究腦缺血的病理生理機(jī)制,以往多采用大鼠作為研究對(duì)象。近年來,隨著基因工程的發(fā)展,轉(zhuǎn)基因小鼠被廣泛用于各種腦缺血損傷機(jī)制的研究,C57BL/6、129X 1/SvJ、Balb/C小鼠是轉(zhuǎn)基因小鼠常用的母系小鼠,為腦缺血研究提供很好的工具。目前多采用小鼠大腦中動(dòng)脈阻塞(MCAO)和雙側(cè)頸總動(dòng)脈夾閉(2-VO)缺血模型用于實(shí)驗(yàn)研究。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用改良的三血管夾閉(兩側(cè)頸總動(dòng)脈和基底動(dòng)脈)復(fù)制 C57BL/6小鼠全腦缺血模型,觀察了不同缺血時(shí)間和不同再灌注時(shí)間對(duì)小鼠腦損傷的影響,為小鼠在腦缺血研究中提供一種較好的模型。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示,腦缺血 8 min再灌注 3 d后海馬CA1區(qū)神經(jīng)元出現(xiàn)了遲發(fā)性變性死亡;缺血 12 min和 16 min后 CA1區(qū)神經(jīng)元變性死亡明顯增多,同時(shí)CA 3、DG區(qū)神經(jīng)元也出現(xiàn)大量死亡,與文獻(xiàn)報(bào)道一致〔5,6〕。提示,隨著缺血時(shí)間延長,海馬神經(jīng)元損傷程度逐漸加重。

各種腦缺血實(shí)驗(yàn)研究表明,腦缺血一定時(shí)間后再灌注2～28 d期間,首先在海馬 CA 1區(qū)出現(xiàn)神經(jīng)元選擇性遲發(fā)性死亡〔5,7〕,隨著再灌注時(shí)間延長,在海馬的其他區(qū)域如 CA 2、CA 3、DG區(qū)相繼出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)元死亡,并且在大腦皮層、丘腦等其他腦區(qū)也有神經(jīng)元的死亡〔5〕。本研究也顯示,小鼠全腦缺血 12min后,再灌注 3、7、28 d三個(gè)時(shí)間點(diǎn),主要引起 CA1區(qū)神經(jīng)元遲發(fā)性死亡,同時(shí) CA3、DG區(qū)以及其他腦區(qū)(大腦皮層、丘腦和紋狀體)也有不同程度的神經(jīng)元死亡。結(jié)果補(bǔ)充了已往的研究,同時(shí)也說明本實(shí)驗(yàn)建立的 3-VO全腦缺血模型的可靠性和穩(wěn)定性,證明該模型的復(fù)制是成功的,該模型是研究腦梗死后神經(jīng)細(xì)胞死亡、神經(jīng)功能修復(fù)和藥物保護(hù)作用,以及小鼠基因操作的較為理想的模型。

1 吳占福,黃瑞英.腦血管疾病的危險(xiǎn)因素及預(yù)防〔J〕.中國老年學(xué)雜志,2009;29(22):2968-71.

2 馬 叢,王 蕾 .小鼠腦缺血再灌注模型方法及中藥的藥理作用〔J〕.中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2008;26(2):280-2.

3 Chen M,Chen Q,Cheng XW,et al.Zn2+mediates ischemia-induced impairment of theubiquitin-proteasomesystem in the rat hippocampus〔J〕.J Neurochem,2009;111(5):1094-103.

4 Ito Y,Ohkubo T,Asano Y,et al.Nitric oxide production during cerebral ischemia and reperfusion in eNOS-and nNOS-knockout mice〔J〕.Curr Neurovasc Res,2010;7(1):23-31.

5 Yonekura I,Kawahara N,Nakatomi H,et al.A model of global cerebral ischemia in C57 BL/6 mice〔J〕.J Cereb Blood Flow Metab,2004;24(2):151-8.

6 Wei G,DoréS.Importance of normothermia control in investigating delayed neuronal injury in a mouse global ischemia model〔J〕.J Neurosci Methods,2010;185(2):230-5.

7 Kumaran D,Udayabanu M,Nair RU,et al.Benzamide protects delayed neuronal death and behavioural impairment in a mouse model of global cerebral ischemia〔J〕.Behav Brain Res,2008;192(2):178-84.