三七總皂甙對脂肪變性 L02肝細胞甘油三酯含量及解耦聯蛋白 2 mRNA表達的影響

張玉佩 楊欽河 孔怡琳 謝 芳 楊環文 程少冰 馮高飛

(暨南大學醫學院中醫系,廣東 廣州 510632)

解耦聯蛋白(Uncoupling Proteins,UCPs)是一種哺乳動物特有的、在褐色脂肪組織中特異表達的線粒體內膜蛋白質,具有調節質子跨膜轉運的作用。目前共發現 5種不同的UCP家族成員,分 別為 UCP1、UCP2、UCP3、UCP4 和 UCP5〔1〕。 其中UCP2具有調節脂質代謝的作用,并受脂質的反饋調節,從而抑制肥胖或脂質代謝障礙時脂質在肝臟沉積,阻止肝細胞脂肪變性,在脂肪肝的發生過程中起重要作用〔2,3〕。三七總皂甙(PNS)為中藥三七提取的有效活性成分,其主要成分為人參皂甙 Rb1、人參皂甙 Rg1、三七皂甙 R1等,具有顯著的降脂、抗脂質過氧化、抗纖維化、改善微循環、保肝、調節機體免疫力等作用〔4～6〕。本實驗從體外途徑建立肝細胞的脂肪變性模型,通過觀察 PNS對脂肪變性 L02肝細胞甘油三酯(TG)含量及 UCP2 mRNA表達的影響,探討其對脂肪變性肝細胞的降脂調控機制。

1 材料與方法

1.1 材料 L02肝細胞株購自中山大學實驗動物中心細胞庫,PNS標準品(編號:870-200001)購自中國藥品生物制品檢定所,小牛血清購自北京普博欣生物科技有限公司,RPMI1640干粉、胰蛋白酶、二甲基亞砜(DMSO)、噻唑藍(MTT)、臺盼藍均為美國 Sigma公司產品,油紅 O染色試劑盒購自廈門信道生物技術有限公司,RNA提取試劑 TRIZOL、RT-PCR試劑盒均為日本 TAKARA公司產品,UCP2、β-actin引物均為上海英駿生物技術有限公司合成。美國Thermo公司CO2恒溫培養箱、美國Thermo公司超速低溫離心機,奧地利 TECAN公司 Tecan-safire2全波長多功能酶標儀,寧波新芝生物科技股份有限公司 JY96-Ⅱ超聲細胞粉碎機,日本日立公司全自動生化分析儀,德國Leica公司 DMI 4000B倒置熒光顯微鏡,美國 BIO-RAD公司梯度 PCR儀、凝膠成像系統分析儀。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 L02肝細胞株常規培養于含 10%小牛血清的 RPMI 1640培養基中,培養條件為37℃,CO2濃度為 5%。根據細胞生長情況,待細胞長至瓶壁 80% ～90%(約每2～3 d),用胰蛋白酶消化收集細胞并傳代。

1.2.2 肝細胞脂肪變性模型的建立 將處于對數生長期的L02肝細胞接種于 6孔培養板中,在 37℃、5%CO2培養箱中孵育貼壁 48h后,更換新鮮培養液,參考范建高造模方法〔4〕改進,予含 50%小牛血清的 RPMI 1640培養基孵育 L02肝細胞48 h,油紅O染色鑒定。鏡下見較多橘紅色脂滴,表示肝細胞脂肪變性模型成功建立〔5〕。見圖 1。

1.2.3 MTT法測定PNS對脂肪變性肝細胞增殖活力的影響將處于對數生長期的L02肝細胞,接種于 96孔板中,共種 2塊板(預留空白孔用于調零)。常規培養 48 h,棄去培養基,加入造模培養基(含 50%小牛血清的 1640培養基)培養 48 h后,棄去培養基。分組處理(每板每組均設 4復孔):空白組(即只含培養液的調零孔),對照組(予 10%小牛血清的 1640培養基),PNS各劑量治療組(分別予含 PNS 1、5、10、50、100、150和200μg/ml的 10%小牛血清培養基),培養 24 h后,每孔加入20μl MTT液(5mg/ml)繼續培養。4 h后,小心吸棄孔內培養上清液,加入 150μl每孔的 DMSO,振蕩 10 min,使結晶物充分溶解。以空白孔調零,通過全波長多功能酶標儀在波長570nm處測出各孔 OD值,并計算細胞存活率。存活率=(用藥組OD值 -空白組 OD值)/(對照組 OD值 -空白組 OD值)×100%。與對照組比較,PNS在 0～50μg/ml范圍內對脂肪變性 L02肝細胞增殖活力無顯著影響(P＞0.05,見表 1),說明PNS在這個濃度范圍內,對脂肪變性 L02肝細胞無毒性,故選取 PNS 10μg/ml作為低劑量治療組,50μg/ml作為高劑量治療組。

1.2.4 實驗分組 實驗分為正常肝細胞組,肝細胞脂肪變性模型組,自然恢復組,PNS低劑量組(10μg/ml),PNS高劑量組(50μg/ml)。除模型組繼續予含 50%小牛血清的 1640培養基培養外,余組均改予含 10%小牛血清的 1640培養基培養。繼續孵育 24h后,檢測相應指標。

1.2.5 油紅O染色觀察肝細胞內脂滴變化 吸棄培養孔中的培養基,用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌 3遍,4%多聚甲醛固定10 min,油紅 O染液閉光染色 20 min,60%異丙醇沖洗 30 s,蒸餾水洗 30 s至背景透明,將培養板放置于倒置熒光顯微鏡下,采用 Leica Qwin plus系統(普通光)拍照。

1.2.6 肝細胞內甘油三酯(TG)含量的測定 吸棄培養孔中的培養基,PBS洗滌細胞 2遍,加入胰酶消化細胞,含 10%小牛血清的 RPMI1640培養基終止消化,并吹打細胞(確保將各孔內的所有細胞吹下),將各孔中的細胞懸液分別移入 1.5 ml離心管中,離心(4℃,1 000 r/min,5 min),棄上清;PBS洗滌細胞2遍,離心(4℃,1 000 r/min,5 min),棄上清;將微量離心管(EP管)置于冰上,每管各加入異丙醇 300μl;用超聲細胞粉碎機裂解細胞 2 min;裂解后,離心(4℃,3 000 r/min,5 min),取上清,全自動生化儀檢測上清中的TG含量。

1.2.7 肝細胞內UCP2 mRNA的表達 將培養板中的培養液棄去,PBS洗滌細胞 2遍,各孔加入 1 ml Trizol,吹打細胞,按Trizol試劑說明書操作,提取細胞總 RNA,電泳分析其完整性,測純度,定量,-20℃冰箱保存備用。逆轉錄反應條件:30℃10 min,42℃ 20min,99℃ 5 min,4℃ 5 min(按 RT試劑盒說明書操作),反應完成后,取出瞬間離心,置 -20℃冰箱保存。引物采用 Primer5.0軟件系統設計和分析。UCP2引物:上游 5′-GACCTA TGA CCT CAT CAA GG-3′,下游 5′-ATA GGT GAC GAA CAT CAC CAC G-3′,擴增片段長度 290 bp;β-actin引物:上游 5′-CCT GTA CGC CAA CAC AGT GC-3′,下游 5′-ATA CTC CTG CTT GCT GAT CC-3′,擴增片段長度 323 bp。擴增條件:95℃預變性 5 min,94℃變性 30 s,55℃退火 30 s,72℃延伸1 min,35個循環,于 72℃再延伸 10 min。PCR擴增產物在同一張 1.0%瓊脂糖凝膠上進行電泳,50 V恒壓電泳 1 h,凝膠圖像分析系統照相并對電泳條帶進行分析,UCP2 mRNA相對表達量以其擴增帶吸光度值與內參照擴增帶吸光度值的比值表示。

1.3 統計學分析 應用SPSS13.0統計軟件進行分析,計量資料以±s表示,采用單因素方差分析。

2 結 果

圖1 肝細胞脂肪變性 48 h模型(油紅 O染色,×400)

2.1 油紅O染色各組肝細胞內脂滴變化情況 正常組:細胞邊緣清晰,細胞內僅見少量橘紅色脂滴;模型組:細胞明顯腫大,輪廓模糊,細胞內可見較多橘紅色脂滴,并出現脂滴融合現象;自然恢復組:細胞邊緣模糊,細胞內均可見較多橘紅色脂滴,但比模型組少;PNS低劑量組和PNS高劑量組:細胞邊緣模糊,細胞內可見少量橘紅色脂滴,較自然恢復組少。見圖 2。

2.2 各組肝細胞內 TG含量的變化情況 與正常組比較,模型組的肝細胞內 TG含量明顯增高(P＜0.01);與模型組比較,自然恢復組肝細胞內 TG含量明顯減少(P＜0.01),但仍與正常組有差異(P＜0.01);與自然恢復組比較,治療 24 h后,PNS各治療組肝細胞內 TG含量均明顯減少(P＜0.05),以低劑量組下降更為顯著(P＜0.01)。見表 2。

表1 PNS各劑量組對脂肪變性肝細胞增殖活力的影響(±s,n=4)

表1 PNS各劑量組對脂肪變性肝細胞增殖活力的影響(±s,n=4)

與對照組比較:1)P＜0.01

組別 OD值 存活率(%)對照組 1.177±0.014 100.0 PNS 1μg/ml 1.156±0.103 98.2 PNS 5μg/ml 1.143±0.052 97.1 PNS 10μg/ml 1.083±0.074 92.0 PNS 50μg/ml 1.051±0.024 89.2 PNS 100μg/ml 1.019±0.0661) 86.6 PNS 150μg/ml 1.007±0.0921) 85.5 PNS 200μg/ml 0.928±0.0971) 78.8

2.3 各組肝細胞 UCP2 mRNA表達水平 各組肝細胞 UCP2 mRNA均有不同程度的表達,模型組表達最高,與正常組比較有顯著差異(P＜0.01);與模型組比較,自然恢復組 UCP2 mRNA表達量略有下降,但無顯著差異(P＞0.05);與自然恢復組比較,PNS各治療組 UCP2 mRNA表達量均有不同程度下調,其中高劑量組下調有顯著性差異(P＜0.05)。見表 2,圖 3。

表2 各組肝細胞內 TG含量及UCP2m RNA的表達(±s)

表2 各組肝細胞內 TG含量及UCP2m RNA的表達(±s)

與正常對照組比較:1)P＜0.01;與模型組比較:2)P＜0.01;與自然恢復組比較:3)P＜0.01,4)P＜0.05

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圖2 PNS治療 24h后各組肝細胞內脂滴的變化(油紅 O染色,×400)

圖3 各組肝細胞UCP2 mRNA表達

3 討 論

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是一種遺傳-環境-代謝-應激相關性肝臟疾病,其發病與肥胖、糖尿病、營養不良、藥物中毒、感染、缺氧等因素有關,其中過量高脂飲食是引起 NAFLD發生的最常見因素,脂質代謝紊亂導致肝細胞內脂質過度蓄積(主要為TG)是形成NAFLD的先決條件〔7〕。UCP2是位于肝細胞線粒體內膜上的載體蛋白,屬于 UCP家族的一員,與 NAFLD的發生、發展密切相關。研究發現〔8〕正常肝細胞 UCP2一般不表達或少量表達,但伴有脂肪肝的ob/ob小鼠肝細胞,以及用脂肪乳培養的正常小鼠肝細胞均有UCP2高表達,說明肝細胞UCP2可能是一種可誘導的基因,增強的UCP2可能進一步調節其靶位基因包括與TG和磷脂合成相關的基因及與多不飽和脂肪酸合成相關的基因等,從而使肝細胞內脂質聚集,引起肝細胞發生脂肪變性。中藥三七具有活血化瘀之功效,臨床上發現其具有降血脂,改善肝微循環障礙,護肝利膽等作用,因此本實驗選擇中藥三七的主要活性成分(PNS)作為處理因素,觀察其對脂肪變性肝細胞的降脂調控機制。

本實驗采用 50%小牛血清誘導 L02肝細胞 48 h成功建立肝細胞脂肪變性模型。50%的小牛血清作為一種高營養物質,其在體外誘導的肝細胞脂肪變性模型與高營養飲食形成的NAFLD病理過程在誘因和致病環節上有著相似之處。實驗結果顯示:正常肝細胞 TG含量和UCP2 mRNA表達很低,模型組肝細胞內 TG含量較正常組明顯增高(P＜0.01),UCP2 mRNA表達明顯增強(P＜0.01),油紅O染色后可見模型組肝細胞內有較多橘紅色脂滴,并出現脂滴融合現象,表明高濃度的小牛血清可引起肝細胞內脂質發生蓄積,究其原因可能與肝細胞對高營養物質攝入增加引起脂質代謝發生紊亂、導致肝細胞對TG的合成增多、TG的轉運和氧化功能出現障礙有關。

本實驗觀察 PNS對脂肪變性肝細胞 TG水平及 UCP2 mRNA表達的影響,結果顯示:與自然恢復組比較,PNS各治療組肝細胞內 TG含量明顯減少,以低劑量組更為明顯;PNS低劑量組 UCP2 mRNA有一定程度的下降,但以PNS高劑量組UCP2 mRNA的表達下降明顯,提示PNS能明顯降低脂肪變性肝細胞內 TG含量,下調 UCP2mRNA的表達,減輕肝細胞脂肪變性,其作用可能不存在明顯的量效依賴關系,在一定劑量范圍內,PNS對脂肪變性肝細胞的降脂作用可能是通過下調 UCP2 mRNA的表達而發揮藥效作用。

本實驗提示,脂質在肝細胞內的蓄積引起肝細胞脂肪變性可能與細胞內 UCP2 mRNA表達上調有關,PNS可能是通過下調 UCP2 mRNA的表達,降低脂肪變性肝細胞內 TG含量,從而改善肝細胞脂肪變性,其全部確切機制有待于進一步研究。

1 Rousset S,Alves-Guerra MC,Mozo J,et al.The biology of mitochondrial uncoupling proteins〔J〕.Diabetes,2004;53(1):130-5.

2 Chavin KD,Yang S,Lin HZ,et al.Obesity induces expression of uncoupling protein-2 in hepatocytes and promotesliver ATPdepletion〔J〕.JBiol Chem,1999;274(9):5692-700.

3 Jun HS,Kim IK,Lee HJ,et al.Effects of UCP2and UCP3 variants on the manifestation of overweight in Korean children〔J〕.Obesity,2009;17(2):355-62.

4 何 晶.三七的藥理作用及研究進展〔J〕.天津藥學,2004;16(5):58-60.

5 Cicero AF,Vitale G,Savino G,et al.Panax notoginseng(Burk)effects fibrinogen and lipid plasma level in ratsfed on a high-fat diet〔J〕.Phytother Res,2003;17(2):174-8.

6 Yuan ZB,Zhang HG,Jia Y,et al.Temporal expression of cyclooxygenase-2 in peritoneal macrophages of rats and effects of panax notoginseng saponins〔J〕.Inflamm Res,2009;58(2):74-80.

7 Cheung O,Sanyal AJ.Abnormalities of lipid metabolism in nonalcoholic fatty liver disease〔J〕.Semin Liver Dis,2008;28(4):351-9.

8 Cortez-Pinto H,Zhi Lin H,Qi Yang S,et al.Lipids up-regulate uncoupling protein 2 expression in rat hepatocytes〔J〕.Gastroenterology,1999;116(5):1184-93.