丹參酮ⅡA對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠血清前膠原末端肽的影響

李醇文 周亞光 陳 娣 梁黔生 楊光田

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院急診科,湖北 武漢 430030)

心肌纖維化(myocardial fibrosis,MF)是高血壓引起心臟病變的主要病理特征之一,其發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚,研究預(yù)防和控制高血壓引起的 MF具有十分重要的臨床意義。丹參酮ⅡA(TanshinoneⅡA,TSN)作為我國(guó)傳統(tǒng)中藥丹參中最重要的血管活性成分,已廣泛應(yīng)用于心血管疾病的治療,但是其作用機(jī)制不是十分清楚。本實(shí)驗(yàn)主要通過觀察血清I型前膠原氨基端肽(PⅠCP)和Ⅲ型前膠原羧基端肽(PⅢ NP)水平的變化,探討TSN對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats,SHRS)MF的影響及其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 SHR 24只,雄性,8周齡,北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供〔合格證號(hào) SCXK(京)2002-2003〕;Wistar大鼠,8只,雄性,8周齡,華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供〔合格證號(hào):SYSY(鄂)2004-0028〕。SHR隨機(jī)分為三組:SHR對(duì)照組,丹參酮組,纈沙坦組;每組 8只。8只 Wistar大鼠為正常對(duì)照組。正常對(duì)照組及 SHR對(duì)照組:注射用水 1 ml/kg腹腔注射;丹參酮組:TSN 40 mg/kg腹腔注射;纈沙坦組:纈沙坦 20 mg/kg灌胃。每日分別給予相應(yīng)的治療1次,共 4 w。

1.2 試劑與儀器 丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液(TSN,諾新康,上海第一生化藥業(yè)有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字 H31022558),纈沙坦(代文,北京諾華制藥有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字 H20040217),PⅠCP和 PⅢNP放免試劑盒(Orion Diagnostica提供),大鼠尾動(dòng)脈血壓計(jì)和 RM6240BD型多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)(成都儀器廠),電子天平等。

1.3 大鼠血壓測(cè)定 采用尾動(dòng)脈套袖法,在清醒、安靜與恒溫(28℃)狀態(tài)下測(cè)量血壓,每只大鼠連續(xù)測(cè)量 3次,取平均值。

1.4 心室質(zhì)量和心室質(zhì)量指數(shù)的檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)大鼠稱體重后處死,取出心臟,用 4℃磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗,濾紙吸干水分后,沿房室交界剪去心房,稱取剩余的心室質(zhì)量,并計(jì)算心室質(zhì)量指數(shù)(心室質(zhì)量/體重)。然后將上述心肌組織部分用于膠原纖維(VG)染色,部分置于-70℃冰箱凍存保存用于mRNA表達(dá)的檢測(cè)。

1.5 心肌VG染色及膠原容積分?jǐn)?shù)測(cè)定 取左室中段橫截面心肌組織,常規(guī)固定、包埋和制片,進(jìn)行 VG染色。然后連接圖像分析系統(tǒng),每張切片隨機(jī)選取 10個(gè)高倍視野(500倍),通過測(cè)量選定區(qū)域染色組織的面積(紅色代表膠原纖維),計(jì)算膠原面積與心肌組織總面積的比值,作為每個(gè)視野中膠原組織占的百分比,取其均值,即為膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)。

1.6 血清 PⅠCP和PⅢNP濃度測(cè)定 從頸動(dòng)脈取血 3 ml,標(biāo)本分離血清置于-20℃冰箱保存待測(cè)。按照放免分析試劑盒說明書提供的方法對(duì)血清PⅠCP和 PⅢ NP濃度進(jìn)行檢測(cè)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件處理,數(shù)據(jù)以±s表示,組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 TSN對(duì)血壓的影響 與正常對(duì)照組比較,SHR對(duì)照組的血壓隨著周齡的增長(zhǎng)而明顯升高(P＜0.01),而經(jīng) TSN和纈沙坦治療 4 w后,兩組血壓較 SHR對(duì)照組明顯下降(P＜0.01)。見圖 1。

2.2 TSN對(duì)心室質(zhì)量和心室質(zhì)量指數(shù)的影響 12 w時(shí),SHR對(duì)照組心室質(zhì)量和心室質(zhì)量指數(shù)均顯著高于其他組(P＜0.01);而與SHR對(duì)照組相比,丹參酮組和纈沙坦組心室質(zhì)量和心室質(zhì)量指數(shù)均有所下降(P＜0.05)。見表 1。

2.3 TSN對(duì)心肌膠原的影響 VG染色法清晰顯示心肌膠原被染呈紅色,分布于心肌內(nèi),主要聚集在血管周圍。正常對(duì)照組心肌細(xì)胞之間、血管周圍有少量膠原纖維。SHR對(duì)照組心肌間質(zhì)和血管周圍膠原纖維明顯增多,且排列紊亂。丹參酮組和纈沙坦組大鼠心肌間質(zhì)和血管周圍膠原積聚明顯減輕,排列也趨向規(guī)則。根據(jù) CVF判斷 MF程度,與正常對(duì)照組比較,SHR對(duì)照組存在著明顯的 MF(P＜0.01);丹參酮組和 Val組MF較 SHR對(duì)照組明顯減輕(P＜0.01)。見圖 2,圖 3。

圖1 8w和 12 w時(shí)大鼠血壓的比較

表1 各組心室質(zhì)量和心室質(zhì)量指數(shù)的比較(±s)

表1 各組心室質(zhì)量和心室質(zhì)量指數(shù)的比較(±s)

與 SHR對(duì)照組比較:1)P＜0.01,2)P＜0.05

組別 n 心室質(zhì)量(g) 心室質(zhì)量指數(shù)(g/kg)正常對(duì)照組 8 0.684±0.0361) 3.33±0.151)SHR對(duì)照組 8 0.774±0.048 3.85±0.46丹參酮組 8 0.702±0.0522) 3.58±0.362)纈沙坦組 8 0.691±0.0442) 3.42±0.232)

圖2 心肌VG染色結(jié)果(×200)

2.4 TSN對(duì)血清 PⅠCP和 PⅢ NP濃度的影響 SHR對(duì)照組的血清 PⅠCP和 PⅢ NP均高于正常對(duì)照組(P＜0.05),丹參酮和纈沙坦組的血清 PⅠCP和 PⅢ NP較SHR對(duì)照組均有不同程度的降低(P＜0.05)。見表 2。組別 n PⅠCP PⅢ NP

圖3 各組心肌膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)

表2 各組血清 PⅠCP和 PⅢNP濃度的比較(μg/L,±s)

表2 各組血清 PⅠCP和 PⅢNP濃度的比較(μg/L,±s)

與正常對(duì)照組比較:1)P＜0.05;與 SHR對(duì)照組比較:2)P＜0.05

正常對(duì)照組 8 71.43±10.37 8.89±3.36 SHR對(duì)照組 8 102.87±13.261) 12.31±5.171)丹參酮組 8 87.21±12.192) 10.46±4.292)Val組 8 84.87±11.232) 10.18±4.572)

3 討 論

心肌中膠原的合成與降解處于動(dòng)態(tài)平衡,以保持膠原含量的穩(wěn)定,一旦二者之間的平衡被打破,膠原產(chǎn)生增多或降解下降,均可使膠原過多沉積,導(dǎo)致 MF。MF是指心肌組織中VG異常沉積,導(dǎo)致其膠原濃度或 CVF顯著升高;是高血壓引起心臟病變的重要原因〔1〕。血清PⅠCP和 PⅢ NP是膠原合成過程中形成的小分子多肽。在膠原合成過程中,血清前膠原末端肽被釋放入血,以游離片段形式出現(xiàn)于循環(huán)中。由于血清前膠原末端肽的釋放與 VG的生成是 1∶1的關(guān)系,所以膠原合成增強(qiáng)的同時(shí)伴隨著血清前膠原末端肽的生成、釋放增加。因此,可以通過檢測(cè)血清前膠原末端肽的水平來評(píng)估心肌膠原合成代謝的程度〔2〕。研究發(fā)現(xiàn),高血壓病患者血清 PⅠCP和 PⅢNP濃度明顯升高且與 MF密切相關(guān)〔3〕。

TSN是我國(guó)傳統(tǒng)中藥丹參中最重要的血管活性成分,本課題組前期研究已經(jīng)證實(shí)其能夠抑制大鼠的心肌肥厚〔4,5〕。唐忠志等人的研究表明丹參能夠預(yù)防和逆轉(zhuǎn)SHR的MF,其機(jī)制可能與抑制心臟局部醛固酮生成、調(diào)節(jié)氧自由基代謝等有關(guān)〔6〕。鄒昌群等人通過體外細(xì)胞培養(yǎng)證實(shí) TSN能夠抑制大鼠心臟成纖維細(xì)胞增殖及表型轉(zhuǎn)化,減少細(xì)胞外基質(zhì)生成,延緩 MF進(jìn)展〔7〕。而本實(shí)驗(yàn)用 SHR來模擬原發(fā)性高血壓,研究發(fā)現(xiàn),與正常血壓對(duì)照組相比,SHR對(duì)照組血壓、心室質(zhì)量、心室質(zhì)量指數(shù)和 CVF均明顯升高,說明SHR血壓升高的同時(shí)伴隨有 MF;而丹參酮組血壓、心室質(zhì)量、心室質(zhì)量指數(shù)和 CVF均有不同程度的降低,說明TSN不僅可以降低血壓亦可以抑制MF,對(duì)心肌具有保護(hù)作用。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn) SHR對(duì)照組血清 PⅠCP和 PⅢNP濃度明顯升高,而丹參酮組則有所降低,說明血清PⅠCP和PⅢNP與 MF密切相關(guān)。由于血清 PⅠCP和 PⅢ NP濃度是反映心肌膠原合成水平的指標(biāo)〔8〕;因此,推測(cè) TSN抑制 MF的機(jī)制是通過抑制心肌膠原的合成來實(shí)現(xiàn)的。然而,MF的調(diào)控因素非常復(fù)雜,TSN具體通過何種途徑抑制心肌膠原的合成,還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

1 Berk BC,Fujiwara K,Lehoux S.ECM remodeling in hypertensive heart disease〔J〕.J Clin Invest,2007;117(3):568-75.

2 楊 銳,陶貴樹.高血壓心肌纖維化的研究進(jìn)展〔J〕.心血管病學(xué)進(jìn)展,2005;26(5):478-80.

3 Diez J.Laviades C,Myaor G,et al.Increased serum concentrations of procollagen peptides in essential hypertension.Relation to cardiac alterations〔J〕.Circulation,1995;91(5):1450-6.

4 Li Y,Yang Y,Yu D,et al.Theeffect of tanshinone IIA upon the TGF-beta1/Smadssignaling pathway in hypertrophic myocardium of hypertensive rats〔J〕.J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci,2009;29(4):476-80.

5 Tu EY,Zhou YG,Wang ZH,et al.Effects of tanshinone IIA on the myocardial hypertrophy signal transduction system protein kinase B in rats〔J〕.Chin JIntegr Med,2009;15(5):365-70.

6 唐忠志,鄭 智,唐 瑛,等.丹參對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠心肌纖維化的逆轉(zhuǎn)作用及其機(jī)制研究〔J〕.華中科技大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2002;31(3),292-4.

7 鄒昌群,占成業(yè),白祥軍.丹參酮ⅡA抗心肌纖維化作用機(jī)制實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.內(nèi)科急危重癥雜志,2008;14(5):242-5.

8 Diez J,Panizo A,Gil MJ,et al.Serum markers collagen type I metabolism in spontaneously hypertensive rats:relation to myocardial fibrosis〔J〕.Circulation,1996;93(3):1026-32.