聲動力化學療法對大鼠腦膠質瘤凋亡及相關基因表達的影響

宋大勇 岳 武 尹立春 林述凱 王 雷 李建華

(北華大學附屬醫院神經外一科,吉林 吉林 132011)

聲動力化學療法(sonodynamic therapy,SDT)是一種腫瘤治療的新方法,對體外大鼠 C6膠質瘤細胞有明顯殺傷作用〔1〕,為觀察 SDT對大鼠腦膠質瘤的生物學效應,本文以大鼠顱內C6膠質瘤為模型,觀察SDT處理后大鼠腦膠質瘤的形態學、凋亡檢測及相關基因表達的變化,以完善SDT抗膠質瘤理論。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 大鼠 C6膠質瘤細胞(哈爾濱醫科大學神經外科研究所)、Wistar大鼠(哈爾濱醫科大學附屬第一醫院實驗動物中心)、血卟啉單甲醚(HMME,北京英發康美技術開發有限公司)、胎牛血清(天津 TBD公司)、RPMI1640培養液 (美國 Hylone公司)、胰蛋白酶(美國 AMRESCO公司)、TUNEL凋亡檢測試劑盒(寶靈曼公司)、兔抗鼠 Cyt-C、Caspase-3免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)、山羊抗兔 IgG免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物制品有限公司)、SABC試劑盒通用型(Zymed公司)、DAB顯色劑(北京中杉金橋生物制品有限公司)。

1.2 儀器 單純照射天使多功能治療儀(天使科技控股有限公司)、大鼠腦立體定向儀(上海江灣Ⅱ型)、MIR機(日本東芝公司 1.5TVISRT型)、倒置相差顯微鏡(日本 Olymp單純照射公司 IX 70型)、CO2培養箱(上海 Herae單純照射公司 BB 5060型)、潔凈操作臺(上海力申科學儀器有限公司 Hfsate1200型)、離心機(上海安亭科學儀器廠 80-2B型)。

1.3 C6膠質瘤細胞培養 C6膠質瘤細胞接種于含 10%胎牛血清的 RPMI1640完全培養液 25 ml培養瓶中,將培養瓶置于37℃、5%CO2和 95%空氣的培養箱中常規培養,待細胞處于對數生長期時實驗。

1.4 大鼠C6腦膠質瘤模型的制作 Wistar大鼠(雄性,體重250～350 g)96只。術前 12 h禁食、禁水,1%戊巴比妥鈉按40 mg/kg腹腔注射麻醉后,固定于江灣Ⅱ型立體定向儀上,常規方法制作大鼠顱內 C6腦膠質瘤模型〔2〕。術后連續 3 d注射青霉素 4萬U/d,常規飼養。

1.5 實驗分組 大鼠接種C6膠質瘤術后 14 d,經MIR掃描,待腫瘤直徑達 3～5mm隨機分成 4組:SDT組(1%戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉后,尾靜脈注射 HMME10 mg/kg,2 h后 1.0 mHz頻率、0.5 W/cm2光強度、120 s照射)、單純照射組、單用HMME組(尾靜脈注射 HMME10 mg/kg)和未處理的對照組,每組 24只。大鼠避光 7 d,常規飼養。

1.6 原位凋亡檢測和Cyt-C蛋白、Caspase-3蛋白表達水平觀察4組大鼠處理后 24 h、3,7d分別隨機處死 8只,開顱取出腫瘤組織。標本常規固定、包埋、切片。①TUNNEL法檢測細胞凋亡情況,方法按照Roche公司原位細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行操作,常規封片,顯微鏡下觀察。結果判定是以核陽性為判定標準,并結合 HE染色 40倍顯微鏡下觀察,對 HE染色證實為壞死的細胞不計數。細胞核內的棕褐色染色為陽性細胞,400倍顯微鏡下每張切片隨機選擇5個視野,兩人雙盲計數 500個細胞中的陽性細胞數,取均值。排除有嚴重的炎癥反應和壞死灶的區域,因為這給單個凋亡細胞的鑒別帶來困難。計算凋亡細胞百分率:凋亡細胞百分率(%)=陽性細胞數/(陽性細胞數 +陰性細胞數)×100%。②標本免疫組織化學染色采用SABC法,按說明書進行操作,常規封片,顯微鏡下觀察。Cyt-C蛋白、Caspase-3蛋白表達結果判定:每張切片 400倍顯微鏡觀察,隨機選擇 5個視野,兩人雙盲計數 500個細胞中的陽性細胞數(細胞胞漿內棕褐色染色),取均值。計算蛋白表達百分率,蛋白表達百分率(%)=陽性細胞數/(陽性細胞數 +陰性細胞數)×100%。對四組各時間點Cyt-C蛋白、Caspase-3蛋白表達率分別與凋亡率計算 Pearson相關系數(r值)。

2 結 果

2.1 一般狀態 在實驗過程中因操作不慎死亡或種瘤失敗的大鼠予以重新補充。大鼠接種后均無感染,從接種后第 3天開始,部分大鼠逐漸出現消瘦、肢活動不靈活、抽搐、易激惹等表現,瀕死前 4組均表現頻發抽搐、極度消瘦、惡病質等癥狀。

2.2 組織學檢查結果 處理前膠質瘤細胞均具有異形性特征,瘤組織內有新生血管形成,腫瘤組織與腦組織無明顯分界。SDT組處理后 24 h腫瘤組織不規則片狀壞死,壞死區中心部分無細胞結構,碎裂、固縮的膠質瘤細胞大量分布于壞死區向正常腫瘤組織過渡的交界區;單純照射組處理后 24h腫瘤組織出現小片狀壞死區,期間散在點狀壞死細胞,亦多分布于壞死區向正常腫瘤組織過渡的交界區(圖 1)。SDT組處理后 3 d腫瘤組織不規則片狀壞死區面積較24 h時明顯減小,壞死區內仍可見較多碎裂、固縮膠質瘤細胞;單純照射組處理后3d腫瘤組織內偶見點狀壞死細胞。SDT組與單純照射組處理后 7 d時膠質瘤組織形態同對照組及HMME組,未見壞死、碎裂的細胞。

圖1 SDT組和單純照射組HE染色處理后 24 h組織學結果(×40)

2.3 原位凋亡檢測結果 HMME組和對照組凋亡細胞極少,各時間點凋亡率比較,無統計學意義(表 1)。切片均未見明顯壞死細胞,偶見凋亡細胞。單純照射組處理后 24 h,切片可見小片狀壞死區和散在分布的壞死細胞,凋亡細胞散在分布,凋亡率明顯高于 HMME組和對照組(P＜0.01);處理后 3 d切片可見散在壞死細胞,偶見凋亡細胞,凋亡率較處理后24h下降,與 HMME組和對照組比較,無統計學意義;處理后 7 d,切片未見明顯壞死細胞,偶見凋亡細胞,凋亡率與 HMME組和對照組比較,無統計學意義。SDT組處理后 24 h,切片可見明顯片狀壞死區或壞死細胞,凋亡細胞多分布于片狀壞死區周邊,或與壞死細胞夾雜,凋亡率明顯高于其他 3組(P＜0.01)(圖 2);處理后 3 d,切片見片狀壞死區明顯縮小、壞死細胞數量明顯減少,凋亡細胞少見,但凋亡率與其他 3組比較差異顯著(P＜0.01);處理后 7d,切片未見壞死細胞,凋亡細胞偶見,凋亡率與其他 3組比較,無統計學意義。

圖2 單純照射組和SDT組原位凋亡檢測處理后 24 h(×400)

2.4 Cyt-C蛋白、Caspase-3蛋白表達結果 HMME組和對照組 Cyt-C蛋白、Caspase-3蛋白表達陽性細胞偶見,Cyt-C蛋白、Caspase-3蛋白表達率各時間點比較,無統計學意義。切片均未見明顯壞死細胞。單純照射組處理后24 h,切片可見小片狀壞死區和散在分布的壞死細胞,Cyt-C蛋白、Caspase-3蛋白表達陽性細胞多分布于小片狀壞死區周邊,或與壞死細胞夾雜,表達率高于 HMME組和對照組(P＜0.01);處理后 3 d切片可見散在壞死細胞,Cyt-C蛋白、Caspase-3蛋白表達陽性細胞偶見,多與壞死細胞夾雜或分布其周邊,但表達率較處理后 24h明顯下降,與 HMME組和對照組比較,無統計學意義;處理后 7 d,切片未見明顯壞死細胞,Cyt-C蛋白、Caspase-3蛋白表達陽性細胞偶見,蛋白表達率與 HMME組和對照組近似,無統計學意義。SDT組處理后 24 h,切片可見明顯片狀壞死區或壞死細胞,Cyt-C蛋白、Caspase-3蛋白表達陽性細胞多分布于片狀壞死區、壞死細胞周邊或夾雜其中,蛋白表達率明顯高于其他 3組(P＜0.01);處理后 3d,切片見片狀壞死區明顯縮小、壞死細胞數量明顯減少,Cyt-C蛋白、Caspase-3蛋白表達陽性細胞多分布于片狀壞死區或壞死細胞周邊,數量也明顯減少,但 Cyt-C蛋白、Caspase-3蛋白表達率與其他 3組比較差異顯著(P＜0.01);處理后 7d,切片未見明顯壞死細胞,Cyt-C蛋白、Caspase-3蛋白表達陽性細胞偶見,蛋白表達率與HMME組和對照組近似,無統計學意義(表 1和圖 3)。

表1 各組大鼠不同時間點凋亡率、Cyt-C和Caspase-3蛋白表達率的比較(±s,%,n=8)

表1 各組大鼠不同時間點凋亡率、Cyt-C和Caspase-3蛋白表達率的比較(±s,%,n=8)

與 SDT組比較:1)P＜0.01;與對照組比較:2)P＜0.01

組別 凋亡率24 h 3 d 7 d Cyt-C蛋白24h 3 d 7 d Caspase-3蛋白24 h 3 d 7 d SDT組 25.10±0.822) 1.23±0.542) 0.23±0.23 36.18±1.382) 1.95±0.502) 0.08±0.10 30.18±1.102) 1.43±0.702) 0.05±0.09單純照射組 6.28±0.681)2) 0.35±0.401) 0.13±0.28 5.90±1.081)2) 0.18±0.231) 0.10±0.19 5.18±0.771)2) 0.08±0.101) 0.00±0.00 HMME組 0.30±0.301) 0.18±0.231) 0.28±0.51 0.20±0.261) 0.08±0.151) 0.03±0.07 0.05±0.091) 0.03±0.071) 0.05±0.14對照組 0.43±0.381) 0.38±0.361) 0.23±0.29 0.08±0.101) 0.10±0.111) 0.08±0.15 0.08±0.151) 0.10±0.111) 0.03±0.07

圖3 SDT組和單純照射組處理后 24 h Cyt-C和 Caspase-3蛋白表達(×400)

2.5 SDT組 Cyt-C和Caspase-3蛋白表達率與凋亡率的相關性分析 Cyt-C蛋白和 Caspase-3蛋白表達率與凋亡率呈正相關(均為 r=0.99,P＜0.01)。

3 討 論

研究表明,化療、放療、基因治療、光動力療法(PDT)等均可促進膠質瘤細胞的凋亡過程,提高療效,延長患者的生存期。研究已經證實 SDT可引起體外 C6膠質瘤細胞凋亡〔1〕,因此凋亡也是 SDT殺傷C6膠質瘤細胞的方式之一。通過組織學及原位凋亡檢查,發現大鼠顱內膠質瘤SDT處理后早期(24h)腫瘤組織壞死及凋亡均達到高峰,隨后壞死及凋亡的瘤組織均逐漸減少,至處理后 7 d時腫瘤組織中已見不到壞死及凋亡的瘤細胞,這表明:①膠質瘤組織壞死和凋亡時間變化規律基本吻合,也表明凋亡是 SDT殺傷膠質瘤的重要方式;②SDT處理大鼠顱內膠質瘤,24 h達到作用高峰,提示SDT如應用于臨床,使用的時間間隔為 24h左右;③凋亡高峰出現于處理后早期(24 h),但凋亡時間較體外(6 h)略后移,這可能因為單純照射作用于體外細胞時衰減低,而作用于顱腦組織中衰減增強,較低的聲強度啟動細胞凋亡時間較長有關;④24 h后細胞凋亡明顯減少,處理后 7d,4組凋亡率已無統計學意義,表明 SDT僅處理后24 h內對細胞凋亡存在明顯影響,而中遠期則無影響。

單純照射處理后也可引起膠質瘤壞死及凋亡,其高峰同樣發生在早期(24 h),但腫瘤壞死面積及凋亡率明顯較 SDT低,提示:①單用單純照射有較弱的抗膠質瘤效應;②凋亡也是單純照射殺傷體內膠質瘤的方式之一。單用HMME未顯示出抗膠質瘤效應,對細胞凋亡無影響。通過與單純照射組、HMME組及對照組比較,表明 SDT的殺傷膠質瘤效應并非簡單的單純照射+HMME效應,而是二者結合發生一系列聲化學反應,激活聲敏劑分子,通過增效聲動力效應殺傷腫瘤細胞。劉全宏等〔3〕提出SDT誘導腫瘤細胞凋亡的途徑有可能依賴于線粒體結構損傷后釋放 Cyto-C等蛋白,激活 Caspase家族蛋白,從而導致細胞凋亡。其中caspase-3作為關鍵蛋白酶,是細胞凋亡蛋白酶級聯反應的必由之路〔4〕。本結果表明 SDT處理后早期出現細胞凋亡可能是損傷線粒體后,釋放Cyto-C,激活Caspase家族蛋白,經過一系列細胞凋亡蛋白酶級聯反應,活化了關鍵蛋白酶caspase-3引起的。單純照射處理后早期(24 h)也出現 Cyto-C、Caspase-3蛋白較強的表達,說明單純照射誘導細胞凋亡可能也與線粒體結構損傷后釋放 Cyto-C等蛋白,激活 Caspase-3有關。單用 HMME未出現 Cyto-C、Caspase-3蛋白的表達,同樣未啟動凋亡。

綜上,SDT對大鼠腦膠質瘤有明顯的抑制效應,早期可能通過損傷線粒體后,釋放 Cyto-C,激活 Caspase-3,直接啟動膠質瘤細胞本身凋亡程序,誘導大鼠腦膠質瘤細胞凋亡。

1 宋大勇,岳 武,趙 釗,等.聲動力化學療法對體外C6膠質瘤細胞作用的研究〔J〕.中華神經外科雜志,2007;23(2):107-10.

2 劉 斌,金必連,李 齡 .激光間質內熱療聯合順鉑治療大鼠腦膠質瘤的實驗研究〔J〕.中國激光醫學雜志,2001;10(2):74-7.

3 劉全宏,王 攀,李 萌,等 .聲化學激活血卟啉誘導艾氏腹水腫瘤細胞凋亡〔J〕.動物學報,2003;49(7):620-8.

4 李小明,孫志賢 .細胞凋亡中的關鍵蛋白酶-Caspase-3〔J〕.國外醫學?分子生物學分冊,1999;21(1):6-9.〔2010-09-11收稿 2010-12-19修回〕