單鏈抗體技術在農獸藥殘留檢測方面的研究進展

齊永華，董永軍，寧紅梅，趙 坤

（河南科技學院動物科學學院，河南 新鄉 453003）

自1975年Kohler和Milstein創立雜交瘤單克隆抗體技術以來[1]，大量可結合蛋白質、碳水化合物、核酸和半抗原的單克隆抗體在免疫檢測領域中就顯示出其獨特的優勢并發揮著巨大作用。基于抗原抗體特異性識別原理的免疫分析技術因其操作簡便、快捷、靈敏度高，越來越多的應用于農獸藥殘留的快速監測。但是隨著應用農獸藥種類和數目的不斷增加，造成了目前農獸藥殘留現狀的復雜性和不確定性，給監測工作帶來了前所未有的挑戰。基于單克隆抗體的傳統免疫分析技術一次僅檢測單個農獸藥的方式已經不能滿足日益增多的大量樣本快速、及時、高效檢測的要求。提高免疫分析檢測的工作效率、縮短檢測時間和簡化操作步驟是其未來發展的主要趨勢，因此發展獸藥的快速多殘留檢測，建立一次分析可以檢測多種同類或不同類農獸藥的免疫分析方法是當前研究的熱點和重點。而農獸藥廣譜性抗體是建立多殘留免疫分析的關鍵試劑，其性質決定著免疫分析的靈敏度和特異性，是目前制約多殘留免疫技術進一步發展的主要瓶頸。20世紀80年代初出現的基因重組抗體技術為廣譜性抗體制備提供了一條嶄新的途徑。在基因重組抗體中，目前應用最為廣泛的當屬單鏈抗體（Single chain variable fragment，scFv）。本文對單鏈抗體的研究進展及其在農獸藥殘留分析方面的應用情況進行簡單綜述。

1 單鏈抗體技術

scFv是抗體分子中保留抗原結合部位的最小功能片段的一種新型重組蛋白，由重鏈可變區（VH）和輕鏈可變區（VL）通過一段約15～25個氨基酸殘基構成的彈性短肽（Linker）以非共價鍵相連而成,分子質量約為完整抗體分子的1/6，具有單一抗原結合位點、分子質量小、組織穿透力強、體內清除快、免疫原性低、易于在大腸桿菌中表達和進行基因進化等特點[2-3]。單鏈抗體技術基本原理：從B淋巴細胞中提取總RNA，經RT-PCR分別擴增出抗體的VH和VL編碼基因，再用Linker將兩者連接成scFv基因，然后通過表達系統進行表達。

1.1 單鏈抗體的構建

scFv基因主要來源于人或動物的外周血淋巴細胞、骨髓、脾細胞和雜交瘤細胞等。即從中抽提總RNA，用純化的mRNA或細胞總RNA逆轉錄成cDNA，再以此為模板擴增出VH和VL基因。抗體的可變區由超變區和骨架區兩部分組成，每個VH和VL的可變區包含3個超變區（CDR），它們共同構成抗原的結合位點，也決定了每種抗體的特異性，其余結構比較保守的可變區，呈B2片層排列，起到連接超變區的骨架作用，稱骨架區（FR）。在獲取可變區基因時，引物的設計可根據FR1和FR4的堿基組成和順序分別合成擴增VH和VL基因的引物。在基因設計中應盡可能保持親本抗體可變區序列的完整性和真實性。此外，scFv基因也可通過基因合成獲得，或者由生物來源及人工合成基因共同構建。

scFv中的VH和VL是由柔性肽段Linker連在一起的，其取向有兩種方式：VH-Linker-VL或VL-Linker-VH，兩種構建方式對scFv的特異性和親和力無明顯影響，但大腸桿菌分泌表達情況不同。此外，Linker對scFv的親和力有重要影響，它承擔著與CL和CH1穩定作用相同的功能，使VH和VL自由折疊，從而維持VH和VL間的構象。Linker長度及性質應不干擾VH和VL的立體折疊,并且不對抗原結合部位造成妨礙。Linker長度必須以不干擾正常功能區結構或功能區間的接觸為標準。一般Linker不應過短，至少含有10個氨基酸，過短可能干擾VH和VL的相互作用；接頭亦不應過長，以免影響抗原抗體結合。目前應用最為廣泛的Linker是重復三次排列組合的4個甘氨酸和1個絲氨酸（（Gly4Ser）3）的15肽序列[4]。

在已知親本抗體可變區DNA基因的基礎上，scFv的構建目前多可采用基因拼接方法，此法有兩種實現形式，即一種是將Linker設計在表達載體上，兩端各引入限制性內切酶位點供VH和VL的插入；另一種是重疊延伸拼接法（Splicing by overlap extension,SOE-PCR）[5]，即將Linker直接設計在擴增VH、VL的引物中，并使連接兩者的引物有15個堿基以上的互補序列，將VH和VL擴增產物混合，經變性、復性及DNA聚合酶催化的延伸反應，VH和VL通過所設計的互補序列，互為引物及模板合成scFv，再以VH、VL兩端引物進行PCR擴增，即可得到完整的單鏈抗體，此法簡單易行，不需要在接頭兩端設計內切酶位點而引入不必要的氨基酸殘基。

1.2 單鏈抗體的表達

目前單鏈抗體主要在原核表達系統E.coli中進行表達。大腸桿菌生長快速,易于操作，轉化和轉導效率高，可在短時間內大規模地生產抗體蛋白，便于純化、分析和應用，而且攜帶外源DNA的大腸桿菌的轉移僅需最少量的DNA，應用大腸桿菌的抗體工程相對便宜[6-7]。然而，大腸桿菌不能對重組抗體進行翻譯后的糖基化修飾，具有一定的局限性,但目前尚沒有證據表明糖基化與抗原結合能力有直接關系。大腸桿菌表達scFv主要有兩種形式：一種是表達為包涵體或非包涵體的不可溶蛋白，表達產量高，可達菌體蛋白的5%～30%，但產生的蛋白常常沒有活性，需經體外溶解、復性、重新折疊、色譜純化等許多步驟，方可獲得有活性的單鏈抗體[8]；另一種是分泌性表達，即在信號肽序列的指導下，scFv分泌到周質腔或培養液中，并完成二硫鍵的形成和肽鏈折疊，成為有活性的可溶性表達產物。后者可直接表達出有活性的scFv，但產量低，每升僅含數毫克[9-10]。

另外，scFv亦可在真核表達系統中進行表達。由真核細胞表達而形成的抗體分子與天然蛋白質一樣能形成鏈間和鏈內二硫鍵，維持正確的蛋白構象以及翻譯后糖基化加工，并分泌到細胞外，成為功能性抗體分子。目前，用于表達單鏈抗體的真核細胞主要有酵母細胞、COS細胞、CHO細胞、植物細胞等[11-14]。

2 單鏈抗體庫技術

單鏈抗體庫技術是繼雜交瘤技術之后，在抗體研究領域中出現的又一重大進展。該技術的產生基于三項技術的發展：反轉錄PCR擴增全套免疫球蛋白可變區基因、大腸桿菌表達分泌功能性免疫球蛋白分子片段的成功，以及噬菌體表面表達技術的建立。其主要步驟如下：①從免疫或未免疫的生物細胞中分離抗體可變區基因；②PCR擴增抗體基因片段，隨機克隆入相應載體，從而形成組合文庫；③轉化細菌,表達產物通過多輪抗原親和吸附，最終篩選出特異性抗體片段。該項技術的根本優勢在于有效的實現了基因型和表型的連接，從而使單鏈抗體基因的人工體外進化和親和成熟得以實現，在生物體外即可獲得具有良好生物學活性的表達產物。目前，單鏈抗體庫技術的發展非常迅速，在抗體表達和展示手段上，除了較為成熟的噬菌體展示技術和核糖體展示技術外，還有細菌展示、酵母展示、質粒展示和mRNA表面展示等多種新型技術[15]。本文主要闡述目前較為成熟的噬菌體展示和核糖體展示技術。

2.1 噬菌體展示抗體庫技術

Smith等于1985年將人工合成的多肽基因插入噬菌體外周蛋白的基因中，并成功地將合成的多肽以多肽－外周蛋白融合的形式表達到噬菌體的表面，這就是噬菌體表面展示技術（Phage display）的開始[16]。該技術的基礎是把外源多肽或蛋白和噬菌體的某種外殼蛋白融合表達于噬菌體表面，一方面,外源多肽或蛋白被展示于噬菌體表面，具有空間上的可接近性；另一方面，噬菌體殼內具有外源多肽或蛋白的編碼序列，由此建立了表型和基因型的聯系，便于進行大規模的有效篩選和體外進化。

噬菌體展示技術是一個極為有效的篩選體系，它將序列不相同的一組多樣化的蛋白或肽鏈表達到噬菌體表面即可得到一個基因文庫,如通過隨機合成制備的短肽庫,利用其表型與基因型的統一以及其易于擴增的特性，可很容易地從基因文庫篩選出與某種靶分子具有特異結合能力的克隆。將文庫與固相化的靶分子一起溫育，表達有靶分子配體的噬菌體顆粒就會結合于固相，洗去游離的噬菌體顆粒，將結合于固相的噬菌體洗脫下來,感染宿主菌進行擴增，可使特異性菌體得到100～1 000倍的富集。然后再重復這一過程。這種“吸附-洗脫-擴增”的富集過程具有顯而易見的優越性：簡便易行，省時省力，一輪篩選1～2 d即可完成；篩選能力極強,無容量限制,足以應付目前技術所能產生的庫容；可直接得到特異克隆所含有的DNA，便于進一步的基因操作。噬菌體展示技術不但可用來篩選針對任何靶標的親和性多肽,而且能夠用來分析蛋白質間相互作用[17]。

隨著分子生物學技術的發展，20世紀90年代初，噬菌體展示技術應用到抗體基因的克隆和表達，它將編碼抗體分子片段的基因與噬菌體外殼蛋白基因末端融合,使表達的抗體附著在噬菌體顆粒表面成熟的衣殼蛋白上,從而形成噬菌體抗體文庫。它將組建億萬種不同特異性抗體可變區基因文庫、抗體在大腸桿菌功能性表達與高效快速的篩選手段結合起來，產生了噬菌體抗體庫技術，成為一個非常強有力的抗體開發工具。這一技術的成功徹底改變了抗體制備的傳統途徑，給抗體基因的篩選工作帶來了革命性的變革，使抗體技術進入到了基因工程抗體時代。

噬菌體展示抗體庫技術采用固相化抗原經“親和吸附-洗脫-擴增”數個循環，可方便、高效地篩選出特異性好、親和力強的噬菌體抗體，含有特異性抗體基因的噬菌體可以直接感染表達細胞進行大量生產，也可對獲得的抗體基因進行突變改造以進一步提高其特異性和親和性。該技術的優點是將抗體的基因型和表型緊密聯系起來；可繞過雜交瘤技術，不需要復雜的基因工程技術；抗體基因篩選的范圍廣；技術穩定、可靠、生產周期短；可規模化生產；適用范圍廣，既可用于抗體制備，也適用于其他蛋白如激素、酶、藥物、隨機多肽等的生產[18-19]。

2.2 核糖體展示抗體庫技術（Ribosome display）

在噬菌體展示技術發展的基礎上，近年來，一種新的完全不依賴于細胞的新技術-核糖體展示技術日趨成熟，其文庫容量不受細胞轉染效率的影響,文庫的多樣性和篩選效率得到大大提高，顯示出誘人的應用前景。

核糖體展示技術是20世紀90年代由Plückthun實驗室在多聚核糖體展示技術的基礎上改進而來的一種完全在體外利用功能性蛋白相互作用進行篩選的新技術，它將正確折疊的蛋白及其mRNA同時結合在核糖體上，形成mRNA-核糖體-蛋白質三聚體，使目的蛋白的基因型和表型聯系起來[20]。核糖體展示技術基本原理是：通過PCR擴增目的基因的cDNA文庫，同時引入T7啟動子、核糖體結合位點及莖環結構，將其轉錄成mRNA，在無細胞翻譯系統（原核的E.coli S30無細胞蛋白質合成系統或真核的兔紅細胞網質裂解系統）中進行翻譯，使目的基因的翻譯產物展示在核糖體表面，形成“mRNA-核糖體-蛋白質”三元復合物，構成核糖體展示的蛋白文庫，之后利用相應的抗原從翻譯混合物中進行液相親和篩選，以乙二胺四乙酸（EDTA）解離結合的核糖體復合物或以特異抗原洗脫整個復合物，并從中分離mRNA。通過反轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）提供下一輪展示的模板，所得DNA進入下一輪富集，最終篩選出高親和力的抗體分子[21]。

核糖體展示抗體庫技術利用抗原抗體特異性結合的特性，便于蛋白富集和抗體文庫篩選；因其篩選抗體的整個過程均在體外進行，不需要經過大腸桿菌轉化的步驟，故而不受宿主細胞及轉染效率的限制，較噬菌體展示技術省時、省力，可以構建更高容量、更高質量的抗體庫，更易于篩選高親和力抗體，以及采用體外進化的方法對抗體性質進行改造[22]。核糖體展示抗體庫技術代表了抗體工程技術的未來發展趨勢，使基因重組抗體技術發展到一個嶄新的階段。

3 單鏈抗體在農獸藥殘留分析方面的應用研究

近年來，隨著基因重組抗體技術日益成熟，單鏈抗體庫技術在農藥殘留和環境污染檢測領域已有不少報道。Alcocer等以抗乙基毒死蜱單抗的良種雜交瘤細胞作為抗體基因來源，構建噬菌體抗體庫，并以大腸桿菌為載體表達、制備了高親和力、高特異性的抗乙基毒死蜱單鏈抗體[23]。2002年，Kramer等同樣以單抗雜交瘤細胞和大腸桿菌表達載體為基礎[24]，構建了噬菌體抗體庫，制備了抗阿特拉津的單鏈抗體，并通過基因定點誘變技術對該抗體庫進行了進一步優化、改善，使scFv對阿特拉津的敏感性提高了25倍，相應的ELISA檢測限由5.1 μg·kg-1降至0.2 μg·kg-1，同時其親和力也由1.27×10-8提高至7.64×10-10。Li等用甲胺磷模擬物對Balb/c小鼠進行免疫，利用免疫脾細胞為基因來源獲取mRNA，構建噬菌體抗體庫，最終得到三株特異性較強的單鏈抗體。在競爭ELISA檢測中，三株重組抗體的IC50分別為46.25、35.39和17.99 μg·kg-1[25]。

此外，單鏈抗體庫技術近年來也開始滲入到獸藥殘留檢測領域。Korpimaki等利用噬菌體抗體庫技術制備的重組抗體對13種磺胺類藥物的交叉反應率明顯優于傳統單克隆抗體。隨后又對重組抗體進行改造，應用獲得的重組抗體建立了能對18種磺胺類藥物進行多殘留檢測的熒光免疫分析方法[26-28]。國內潘科等利用噬菌體展示技術在雜交瘤細胞基礎上制備出抗鹽酸克倫特羅重組抗體，其對克倫特羅的敏感性優于其親本代單克隆抗體，交叉反應性與單克隆抗體相似[29]。此外，筆者等利用核糖體展示技術在雜交瘤細胞基礎上制備出了抗磺胺二甲嘧啶重組抗體[30]。由此可預知，單鏈抗體技術在未來農獸藥殘留分析中將占據重要地位。

綜上所述，隨著分子生物學、分子免疫學的發展及各種抗體庫技術的日趨成熟，單鏈抗體現已廣泛滲入到農獸藥等小分子化合物的殘留分析領域中，與此同時將在未來發揮重大作用。它借助基因重組抗體技術，將同類或不同類多種農獸藥分子的單鏈抗體基因整合到一起，建立抗體庫，篩選天然重組抗體，并運用抗體-獸藥分子定量構效關系模型、氨基酸序列對比和蛋白質同源模擬等技術進一步改造，有望獲得可用于獸藥多殘留快速免疫分析的廣譜性抗體，從而為發展簡便、快速、高效的農獸藥多殘留免疫分析技術提供一條嶄新途徑。

4 單鏈抗體技術的不足與展望

單鏈抗體技術經過了近30年的發展，從體內展示發展到體外獲得目標分子，取得了許多應用成果，但是其篩選獲得的一些靶標在實際應用時仍然存在一些問題，如親和力較低，穩定性較差，半衰期短等。例如有些單鏈抗體親和力低于其親本單克隆抗體，這就成為它在免疫分析等應用中的一個制約因素，后續我們可以通過親和力成熟對單鏈抗體的親和力進行改進，或者通過構建多價抗體來增加抗體的功能親和性。但是隨著分子生物學的快速發展，各種技術手段及分子進化水平的不斷提高，上述制約因素將會被一一剔除。總之，單鏈抗體技術與其他技術相比，其優勢是十分明顯的，它以其無可比擬的文庫容量和成熟簡便的進化手段必將顯現其巨大的潛力，在蛋白質互作，功能蛋白和多肽的篩選，蛋白分子定向改造，小分子化合物單鏈抗體制備和新藥研制開發等方面將發揮重要作用。

[1] Kohler G,Milstein C.Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity[J].Nature,1975,256(5517):495-497.

[2] Blazek D,Celer V.The production and application of single-chain antibody fragments[J].Folia Microbiol(Praha).2003,48(5):687-698.

[3] Bird R E,Hardman K D,Jacobson J W,et al.Single-chain antigen-binding proteins[J].Science,1988,242(4877):423-426.

[4] Krebber A,Bornhauser S,Burmester J,et al.Reliable cloning of functional antibody variable domains from hybridomas and spleen cell repertoires employing a reengineered phage display system[J].J Immunol Methods,1997,201(1):35-55.

[5] Horton R M,Cai Z L,Ho S N,et al.Gene splicing by overlap extension:tailor-made genes using the polymerase chain reaction[J].Biotechniques,1990,8(5):528-535.

[6] Pepper L R,Cho Y K,Boder E T,et al.A decade of yeast surface display technology:Where are we now[J].Comb Chem High Throughput Screen,2008,11(2):127-134.

[7] Fernandez L A.Prokaryotic expression of antibodies and affibodies[J].Curr Opin Biotechnol,2004,15(4):364-373.

[8] Xiong H,Li S,Yang Z,et al.E.coli expression of a soluble,active single-chain antibody variable fragment containing a nuclear localization signal[J].Protein Expr Purif,2009,66(2):172-180.

[9] Chadd H E,Chamow S M.Therapeutic antibody expression technology[J].Curr Opin Biotechnol,2001,12(2):188-194.

[10] Verma R,Boleti E,George A J.Antibody engineering:comparison of bacterial,yeast,insect and mammalian expression systems[J].J Immunol Methods,1998,216(1-2):165-181.

[11] Mattanovich D,Gasser B,Hohenblum H,et al.Stress in recombinant protein producing yeasts[J].J Biotechnol,2004,113(1-3):121-135.

[12] Norderhaug L,Olafsen T,Michaelsen T E,et al.Versatile vectors for transient and stable expression of recombinant antibody molecules in mammalian cells[J].J Immunol Methods,1997,204(1):77-87.

[13] Hobson-Peters J,Shan J,Hall R.A,et al.Mammalian expression of functional autologous red cell agglutination reagents for use in diagnostic assays[J].J Virol Methods,2010,168(1-2):177-190.

[14] Eldin P,Pauza M E,Hieda Y,et al.High-level secretion of two antibody single chain Fv fragments by Pichia pastoris[J].J Immunol Methods,1997,201(1):67-75.

[15] 沈倍奮,陳志南,劉民培.重組抗體[M].北京:科學出版社,2005:118-121.

[16] Smith G P.Filamentous fusion phage:Novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface[J].Science,1985,228(4705):1315-1317.

[17] Cai J,Liu Z,Wang F,et al.Phage display applications for molecular imaging[J].Curr Pharm Biotechnol,2010,11(6):603-609.

[18] Eteshola E.Isolation of scFv fragments specific for monokine induced by interferon-gamma(MIG)using phage display[J].J Immunol Methods,2010,358(1-2):104-110.

[19] Zhao P,Tao D,Liang Z,et al.A novel protein equalizer based on single chain variable fragment display M13 phage library for nephropathy patient urine study[J].Se Pu,2009,27(3):249-253.

[20] Hanes J,Pluckthun A.In vitro selection and evolution of functional proteins by using ribosome display[J].Proc Natl Acad Sci USA,1997,94(10):4937-4942.

[21] Hanes J,Jermutus L,Schaffitzel C,et al.Comparison of Escherichia coli and rabbit reticulocyte ribosome display systems[J].FEBS Lett,1999,450(1-2):105-110.

[22] Hanes J,Jermutus L,Pluckthun A.Selecting and evolving functional proteins in vitro by ribosome display[J].Methods Enzymol,2000,328:404-430.

[23] Alcocer M J,Doyen C,Lee H A,et al.Functional scFv antibody sequences against the organophosphorus pesticide chlorpyrifos[J].J Agric Food Chem,2000,48(2):335-337.

[24] Kramer K.Evolutionary affinity and selectivity optimization of a pesticide-selective antibody utlizing a hapten-selective immunoglobulin repertoire[J].Environ Sci Technol,2002,36(22):4892-4898.

[25] Li T,Zhang Q,Liu Y,et al.Production of recombinant scFv antibodies against methamidophos from a phage-display library of a hyperimmunized mouse[J].J Agric Food Chem,2006,54(24):9085-9091.

[26] Korpimaki T,Rosenberg J,Virtanen P,et al.Improving broad specificity hapten recognition with protein engineering[J].J Agric Food Chem,2002,50(15):4194-4201.

[27] Korpimaki T,Brockmann E C,Kuronen O,et al.Engineering of a broad specificity antibody for simultaneous detection of 13 sulfonamides at the maximum residue level[J].J Agric Food Chem,2004,52(1):40-47.

[28] Korpimaki T,Hagren V,Brockmann E C,et al.Generic lanthanide fluoroimmunoassay for the simultaneous screening of 18 sulfonamides using an engineered antibody[J].Anal Chem,2004,76(11):3091-3098.

[29] Pan K,Wang H,Zhang H B,et al.Production and characterization of single chain Fv directed against beta2-agonist clenbuterol[J].J Agric Food Chem,2006,54(18):6654-6659.

[30] Qi Y,Wu C,Zhang S,et al.Selection of anti-sulfadimidine specific scFvs from a hybridoma cell by eukaryotic ribosome display[J].PLos One,2009,4(7):6427.