手足口病腸道病毒EV71和CoxA16感染的檢測分析

黃建國 ，吳立文 ，駱志輝 ，黃碧梅 ，劉菊花 ，劉彩珍

(1、廣東省龍川縣婦幼保健院檢驗科；2、兒科；3、廣東省龍川縣人民醫院兒科，廣東 龍川 517300)

手足口病(Hand-foot-mouth disease,HFMD)是由多種腸道病毒引起的常見傳染病，以嬰幼兒發病為主。大多數患者癥狀輕微，以發熱和手、足、口腔等部位的皮疹或皰疹為主要特征。引起手足口病的病原體主要為腸道病毒71型(EV71)和柯薩奇病毒A組16型(CoxA16)，其中EV71不僅引起HFMD，而且可引起腦膜炎、腦炎、急性遲緩性癱瘓等嚴重中樞神經系統并發癥[1]。從1996年來，在東南亞、中國臺灣、香港等地不斷有HFMD暴發流行[2-3]。2008年在我國安徽和河南部分縣市發生EV71感染引起的HFMD流行，并造成患兒死亡。近年，地處廣東東北部山區的龍川縣也出現HFMD散發病例，以每年4～6月間為發病高峰。我們收集了部分在我院和龍川縣人民醫院住院和門診就診的臨床疑似手足口病的患兒標本，應用分子生物學方法對這些標本進行了腸道病毒基因檢測，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 臨床病例 所有病例均來自我院和龍川縣人民醫院2009至2010年住院和門診病人，按照衛生部《手足口病預防控制指南(2008年版)》標準[4]，共收集臨床診斷手足口病病例56例，其中男32例，女25例，年齡5月～12歲。

1.2 標本的采集 用無菌方法采集急性期病人的糞便1～2g，置于滅菌的帶蓋玻璃瓶中，同時用干棉簽準確地擦拭患兒的鼻咽部后，立即浸泡于含2～3ml Hank＇s液的滅菌試管,以上標本均立即-70℃凍存。

1.3 實驗試劑 10×PCR緩沖液、dNTPs、Taq DNA聚合酶、隨機引物、RNAsin酶和AMV逆轉錄酶為Promega公司產品，病毒核酸提取試劑為美國GIBCOL公司的TRIZOL-LSReagent RNA提取試劑盒。

1.4 引物序列[5]引物由南方醫科大學附屬深圳寶安醫院兒科張壽斌主任提供。所用的引物序列見表1。

表1 RT-PCR檢測EV所用的引物及序列

1.5 EV核酸提取 采用TRIZOL-LSReagent提取總 EV RNA。 取 0．5～1g 糞便溶解于 0.5～2ml生理鹽水中，充分振蕩混勻，5000r/min離心5min，取150μl上清液 (或咽拭子液)，加 TRIZOL-LS Reagent 450μl， 混勻， 加 120μl氯仿，2～8℃12000g 離心15min， 取上清液加 300μl異丙醇，2～8℃12 000g離心 10min， 沉淀物用 75%乙醇 200μl洗脫，2～8℃7500g離心5min后去離子水溶解，凍存于-70℃。

1.6 EV通用引物的RT-PCR檢測 逆轉錄合成cDNA 反 應 ： 取 5 ×AMV buffer 3.0μl，20mmol/L dNTPs 0.15μl， 隨 機 六 聚 體 引 物 l.0μl，EV 模 板10μl，cDNA 反應液總體積為 15μl，反應參數：42℃，45min。采用套式PCR檢測EV RNA，第一輪PCR反 應 條 件 ：cDNA 模 板 5μl，10×PCR buffer 3.0μl，20mmol/L dNTPs 0.15μl，50μmol/L EVP160/EVP580各 0.15μl，Taq 酶 1U， 反應液總體積共 30μl，在PE6000型DNA擴增儀上擴增，擴增參數：94℃預變性 180s，94℃ 40s，55℃ 40s，72℃ 40s，擴增 30 個循環。第二輪PCR反應條件：取第一次PCR產物3μl作模板，用 50μmol/L EVP250/EVP 500引物各0.15μl進行第二次擴增，擴增條件同第一輪。取第二輪PCR產物10μl用2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色(含 EB 0.5μg/ml)，100V 電泳 30min，紫外燈下觀察，約于312bp位置見清晰條帶為陽性。每次均設腸道病毒標準IYW作陽性對照和PBS液陰性對照，標本處理RNA提取、PCR擴增和凝膠電泳PCR產物檢測均在不同實驗室進行。

1.7 RT-PCR特異檢測EV71和CoxA16采用RT-nPCR檢測EV71和CoxA16引物見表1，第一輪PCR擴增反應條件基本同上述通用引物檢測EV，只是檢測EV71第二輪PCR退火溫度為58℃，檢測CoxA16第二輪PCR退火溫度為56℃，片段大小分別為193bp和275bp。

1.8 統計學方法 配對計數資料采用 χ2檢驗，P＜0.05，差別有顯著性意義。

2 結果

2.1 手足口病腸道病毒RT-nPCR檢測結果

用通用引物RT-nPCR檢測共56例病人的標本，結果37例病人呈現總腸道病毒陽性，陽性率66.1%。再用RT-nPCR方法進行分型檢測，檢出EV71陽性 15份，占標本總數的26.8%；CoxA16陽性13份，占標本總數的23.2%；EV71和 CA16均陰性9例，占標本總數的 16.1%。RT-nPCR分型檢測結果見圖1。

圖1 RT-nPCR分型檢測電泳結果

2.2 不同性別嬰幼兒童 EV71和CoxA16檢出情況

對56份臨床診斷手足口病病例中，其中男32例，女25例，男女陽性率分別為62.5%(20/32)和68%(17/25)；EV71男女陽性率分別為31.3%(10/32)和20%(5/25)；CoxA16男女陽性率分別為18.8%(6/32)和 28%(7/25)。 經統計學處理(χ2=0.6575，P＞0.05)，不同性別間EV71及CoxA16的發病率差別無統計學意義(見表 2)。

表2 手足口病病原體檢測結果的性別分布(%)

2.3 不同年齡兒童EV71和CoxA16檢出情況

將病例分為 6個年齡組，5歲以下兒童是 EV感染的高危人群，占85.7%(48/56)。EV71感染者中最小年齡11個月，最大8歲(見表3)。

表3 不同年齡段手足口病病原體檢測結果(%)

3 討論

人類腸道病毒(EV)屬于小RNA病毒科，有近70個血清型，包括脊髓灰質炎病毒，柯薩奇病毒A組和B組，埃可病毒以及新型腸道病毒EV68-72型。EV感染較為常見，臨床表現復雜多樣，手足口病(HFMD)是其常見的臨床表現之一。EV71是1972年美國學者從一腦炎病人中分離出一種新型腸道病毒，是上世紀九十年代末在東南亞部分地區爆發流行的主要病原體[3]。EV71感染以手足口病為主，部分出現嚴重的中樞神經系統感染，導致肺水腫和肺出血而死亡。2008年在我國的山東臨沂和安徽阜陽河南等地區出現手足口病疫情，也主要由EV71型為主。我省的深圳和廣州近年均有手足口病散發流行[6-7]，我縣地處廣東東北部山區，近年也出現HFMD散發病例，以每年4～6月間為發病高峰，為了了解在本地區出現的手足口病的血清型，我們收集了56例在我院住院和門診就診的手足口病病例，先采用腸道病毒5’端保守的非編碼區通用引物RT-nPCR檢測，并根據EV71和CoxA16病毒特異性引物,對通用引物陽性的病例進行EV71和CoxA16病毒的快速RT-nPCR分型檢測，結果顯示，56例臨床診斷手足口病病例，37例腸道病毒通用引物 RT-nPCR檢測呈陽性，陽性率為66.1%，敏感性略低于實時熒光定量 RT-PCR檢出率[8]。分型檢測顯示，在我縣流行的手足口病病原體也主要是腸道病毒EV71和CoxA16血清型，占75.7%(28/37)，與在我省的深圳和廣州流行情況相似，發病以嬰幼兒為主 (年齡<5歲以下兒童)，不同性別之間無明顯差別。

EV的臨床檢測方法主要有血清學方法和分子生物學方法。血清學方法包括補體結合試驗、中和試驗或ELISA法，但由于EV血清型繁多，并且許多血清型抗體間有交叉反應，特異性較差，加之抗體滴度感染2周后才能達到檢出水平，EV特異性血清學檢測方法目前還不成熟，臨床應用存在諸多限制。近年發展的檢測EV感染的分子生物學方法主要有RT-nPCR和實時熒光定量PCR，具有較高的敏感性和特異性[5，9]。我們采用的是套式RT-nPCR技術，進行兩次特異性引物PCR擴增，提高了檢測結果的特異性，也避免一次PCR擴增出現的假陰性，增加了檢測的敏感性，RT－nPCR檢測當天即可完成，是一種快速、敏感和特異的方法，適合應用于對EV感染的檢測和早期診斷。我們檢測的56例病人中，檢測的標本包括糞便和呼吸道分泌物，采用RT-nPCR均檢測出EV，有報道該方法適用于呼吸道分泌物、糞便、腦脊液和組織中EV RNA的檢測，是診斷EV感染的有效方法[6]。

手足口病雖然是一種自限性疾病，但EV71型感染部分侵犯腦組織，可造成患兒死亡，對EV71至今尚無疫苗預防，一旦發病沒有特異性藥物治療，因此對EV71等EV采取有效的預防控制措施至關重要。包括加強對公共場所及托幼機構衛生的監測力度，實行早發現、早診斷、早報告、早隔離治療、早處理疫點等措施。

[1]陸一涵,姜慶五.人腸道病毒 71型與手足口病[J].疾病控制雜志,2008,12(3):183-188.

[2]Ho M.An epidemic of enterovirus 71 infection in Taiwan[J].New Engl JMed,1999,341(13):929-935.

[3]Cardosa MJ,Perera D,Brown BA,et al.Molecular epidemiology of human enterovirus 71 strains and recent outbreaks in the Asia-Pacific region:comparative analysis of the VP1 and VP4 genes[J].E-merg Infect Dis,2003,9:461-468.

[4]中華人民共和國衛生部.2008年手足口病預防控制指南[J].中華實驗和臨床感染病雜志,2008,2(3):210-213.

[5]張壽斌,廖 華,黃呈輝,等.應用通用引物建立巢式逆轉錄聚合酶鏈反應檢測腸道病毒[J].中國醫師雜志,2006,8(7):971-973.

[6]張壽斌,廖 華,黃呈輝,等.深圳237例手足口病腸道病毒血清型基因及臨床特征[J].中國當代兒科雜志,2008,10(1):38-41.

[7]吳新偉,蔣力云,伍業健.廣州地區 2008年手足口病病原體檢測分析[J].廣東醫學,2009,30(5):788-790.

[8]嚴菊英,盧亦愚,徐昌平,等.腸道病毒 TaqMan熒光定量 RT-PCR法快速檢測[J].中國公共衛生,2007,23(7):818–8201.

[9]何雅青,何麗蕓,姚相杰,等.熒光定量 RT-PCR快速檢測手足口病病原研究[J].中國熱帶醫學,2008,8(10):1675-1671.