蛋白酶K對鹽析法提取全血DNA的影響

賈二娟，朱偉鋒，余樂涵

(1、許昌市中心醫院檢驗科，河南 許昌 461000；2、南昌大學醫學院生物化學與分子生物學教研室，江西 南昌 330006)

鹽析法是目前血液基因組DNA常用的提取方法之一，具有簡便、快速、得到DNA的質量高的特點[1]。但有的研究中使用了蛋白酶K[2，3]，有的研究中未使用蛋白酶K[1，4]，均得到了高質量的DNA。為了了解蛋白酶K在鹽析法提取全血DNA中的作用，我們以兔血為例進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料 10份4℃保存1個月的5%EDTA抗凝血樣(EDTA量約占全血量的2/5)由南昌大學醫學實驗教學部生物化學與分子生物學實驗室提供。兔血混勻后分蛋白酶K、非蛋白酶K兩組進行實驗，每組10份血樣，每份血樣200μl。所用試劑包括：Ⅰ液(10mmol/L Tris-HCl，10mmol/L KCl，10mmol/L Mg-Cl2，2mmol/L EDTA，25ml/L Trito X-100，pH 8.0)，Ⅱ液 (10mmol/L Tris-HCl，10mmol/L KCl，10mmol/L MgCl2，2mmol/L EDTA，0.4mol/L NaCl，1% SDS，pH8.0)，20mg/ml蛋白酶 K，5mol/L NaCl， 異丙醇，70%乙醇和 TE(10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH 8.0)。所用試劑均為分析純級。

1.2 DNA提取 ①200μl血樣加入Ⅰ液1ml，混勻，室溫放置10min，12000r/min離心2min，棄上清，沉淀再加入Ⅰ液1ml，振蕩，使沉淀散開，12000r/min離心2min，棄上清。②沉淀加入Ⅱ液200μl，蛋白酶K組加入10μl蛋白酶K，非蛋白酶K組不加蛋白酶K，振蕩，使沉淀散開，65℃ 30min，期間混勻2次。③加入 100μl 5mol/L NaCl，混勻，15000r/min 離 心5min，轉移液體到新的離心管。④加入等體積異丙醇，充分混勻，15000r/min離心5min，棄上清。⑤沉淀加入70%乙醇1ml，15000r/min離心 5min，棄上清。⑥瞬時離心，將離心管管底乙醇吸出，振蕩培養箱 37℃放置 2min，加入 TE 50μl。

1.3 DNA濃度和純度檢測 用PUEX紫外分光光度計檢測檢測DNA的紫外吸收值，計算DNA的濃度和純度。

1.4 PCR擴增 對兔線粒體tRNALeu(UUR)基因[5]進行擴增，上游引物：5＇-TCCCAGTACGAAAGGACAAGA-3＇， 下游引物：5＇-TCGTTCGACTAAGGTGAGGAA-3＇，擴增片段長度為270bp。PCR反應體系為20μl，包含 SinoBio 2×Taqmastermix 10.0μl，上下游引物各 0.4μl(10μmol/L)，模板 1.0μL，ddH2O 8.2μl。PCR 反應條件：94℃預變性 5min；94℃變 性 30s，61℃退火 30s，72℃延伸 20s，35 個循環；72℃ 5min。1.5瓊脂糖凝膠電泳 PCR擴增完成后取5μl PCR產物在2%瓊脂糖凝膠上進行電泳，凝膠成像系統照像。

1.6 用SPSS 12.0對所得數據進行統計學分析。

2 結果

2.1 DNA濃度和純度檢測結果 兩種方法提取的DNA在DNA量和純度上均沒有統計學差異 (表1)(P＞0.05)。

2.2 瓊脂糖凝膠電泳結果 瓊脂糖凝膠電泳顯示所有樣本得到了有效擴增，擴增片段位于200bp和300bp之間接近300bp處，大小與預計片段的大小一致。圖1為蛋白酶K組PCR產物電泳圖，圖2為非蛋白酶K組PCR產物電泳圖。

表1 兩種方法提取的DNA量和純度的比較

圖1 蛋白酶K組PCR產物電泳圖

3 討論

圖2 非蛋白酶K組PCR 產物電泳圖

一個好的DNA提取的方法應該是在保證DNA質量的前提下便捷而高效[6]。鹽析法提取DNA具有簡便、快速、經濟、得到DNA質量好的特點，是目前常用的DNA提取方法[7]。在DNA提取中，蛋白酶K的作用是將所有蛋白降解成為小片段的肽鏈或氨基酸，使DNA分子完整地被分離出來[8]。本研究發現蛋白酶K對結果的影響不大，在DNA量和純度兩個方面，加入蛋白酶K和不加蛋白酶K得到的結果均沒有統計學差異，原因可能是在細胞裂解液中有SDS的存在。SDS是離子型表面活性劑，能溶解細胞膜上的脂質與蛋白質，從而破壞細胞膜結構；且能解聚細胞中的核蛋白，使蛋白質變性而沉淀下來[9]。因此，使用鹽析法提取全血中的基因組DNA時，可以不使用蛋白酶K。

[1]焦 鵬,葉文靜,常 起,等.人血細胞DNA無酚提取法[J].基礎醫學與臨床,2007,27(8):919-920.

[2]Miller SA,Dykes DD,Polesky HF.A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells[J].Nucleic Acids Res,1988,16(3):1215.

[3]Grimberg J,Nawoschik S,Belluscio L,et al.A simple and efficient non-organic procedure for the isolation of genomic DNA from blood[J].Nucleic Acids Res,1989,17(20):8390.

[4]Lahiri DK,Nurnberger JIJr.A rapid non-enzymatic method for the preparation of HMW DNA from blood for RFLP studies[J].Nucleic Acids Res,1991,19(19):5444.

[5]高 洪,彭 輅,王德成,等.內毒素致兔線粒體DNA基因突變的SSCP檢測[J].中國獸醫學報,2007,27(3):373-375.

[6]劉 燕,劉孟洲,徐彥祥.3種提取基因組DNA方法的比較分析[J].中國畜牧獸醫,2008,35(4):754-758.

[7]張冬會,史英欽,張文杰.外周血DNA提取方法及其特點[J].中國組織工程研究與臨床康復,2007,11(11):2167.

[8]吳清敏,劉巧紅,膝 云,等.外周血DNA提取方法的比較[J].中華檢驗醫學雜志,2004,27(7):445-446.

[9]杜金子,陳麗梅,黃榮韶,等.改良SDS法提取石韋基因組DNA的研究[J].西南農業學報,2009,22(3):754-758.