異丙酚對胚胎大鼠中腦神經細胞缺氧復氧損傷的影響

張立平

(溧水縣人民醫院檢驗科，江蘇 南京 211200)

目前異丙酚的腦保護研究主要以神經元為對象，有關異丙酚對胚胎中腦神經細胞缺氧復氧損傷的影響報道較少。異丙酚是臨床十分常用的麻醉鎮靜藥[1，2]，有研究顯示異丙酚具有一定的腦保護作用[3]。本實驗旨在進一步研究異丙酚干預胚胎中腦神經細胞后缺氧復氧損傷神經細胞形態、乳酸脫氫酶、脂質過氧化的影響,進一步說明異丙酚對腦缺血再灌注損傷有保護作用，為異丙酚在臨床上的進一步應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 14d胚胎大鼠，體重為250～300g(江蘇大學實驗動物中心提供)。

1.2 主要試劑和儀器 小牛血清(杭州四季青生物公司)；DMEM培養基為(美國Sigma公司)；異丙酚由暨南大學生物工程研究所提供(純度＞95%)；MTT(武漢博士德生物工程有限公司)；乳酸脫氫酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；CO2培養箱為(Forma Scientific，USA)；ELx800 酶標儀 (美國 BIO-TEK公司)。IX70-S8F/SIF-141倒置相差顯微鏡(Olympus公司,日本)；GNL-B3氧量分析儀(上海昶艾電子科技有限公)； 95%N2-5%CO2混合氣平衡過的單向氣流缺氧裝置(蘇州安創儀器有限公司)。

1.3 胚胎中腦神經細胞的制備 用脫頸椎法處死妊娠14 d孕鼠，在無菌條件下分離出胎鼠中腦，浸入37℃的胎牛血清。 Hanks平衡液(1:1v/v)5～10min，用Hanks液漂洗3次后，用0.25%胰蛋白酶消化10min，加入小牛血清終止消化后經200目鋼絲網篩過濾，離心洗去胰蛋白酶。加入DMEM培養液(內含50U/ml的青霉素，50μg/ml的鏈霉素和15%小牛血清)制備細胞懸液，計數細胞存活率，采用臺盼藍計數活細胞。結果活細胞率為90%，再用含10%小牛血清的DMEM培養基將細胞密度調整至3×105個細胞/ml的細胞，將細胞懸液接種于培養板中，置37℃、5%CO2、95%空氣飽和濕度培養箱中培養,細胞培養24h后進行后續試驗。

1.4 胚胎中腦神經細胞缺氧損傷模型的建立 取培養24小時的神經細胞，用15%胎牛血清DMEM培養基連續培養,(預先充入95%N2-5%CO2混合氣和30min)，而后迅速將培養細胞移入同種95%N2-5%CO2混合氣平衡過的單向氣流缺氧裝置,測氧儀監測排氣口氧濃度(＜1%)，于37℃電熱恒溫培養箱中缺氧6h后進行MTT實驗及生化指標的測定。

1.5 實驗分組 將胚胎中腦神經細胞分組 正常對照組、缺氧損傷模型組、異丙酚干預組(濃度分別為10、25、50、100μmol/L)。 1.5MTT 法檢測神經元細胞存活率 以4×105個細胞/ml的細胞接種于96孔培養板的神經細胞，缺氧損傷模型組及異丙酚干預組缺氧處理24h，正常對照組37℃、5%CO2培養箱同步孵育，每孔加入 MTT溶液(5mg/ml)20μl，37℃繼續孵育4h，終止培養，小心吸棄孔內培養液，每孔加入150μl DMSO，振蕩 10min，于酶標儀波長 490nm處測吸光度值。每實驗組設6個復孔。

1.6 細胞外LDH活性的測定 接種于24孔板的神經元，缺氧損傷模型組及異丙酚干預組缺氧處理24h，正常對照組37℃、5%CO2培養箱同步孵育，取各組細胞培養上清液200μl，用比色法測定LDH的活力,具體檢測過程及操作方法參見試劑盒說明書進行。

1.7 細胞內SOD活性、MDA和GSH含量測定 接種于24孔板的神經元,各實驗組處理同上，0.25%胰酶消化，血清中止，離心1000r/min，10min，去上清后，每孔加入0.1mol/L TBA-0.05mmol/L EDTA(pH=8.0)1ml，再加入 50μl 1%Triton-X100，將培養板置于震蕩器上震蕩 1min使細胞溶解，加入100μl 25%HPO3以沉淀蛋白，10000r/min 4℃離心。用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性，用改良二硫雙硝基苯甲酸定量法測定GSH活性，按硫代巴比妥酸(Thibabituric acid，TBA)比色法測定MDA含量。用黃嘌呤氧化酶法測定細胞內SOD活性；用硫代巴比妥酸比色法測定細胞內MDA含量，具體檢測過程及操作方法參見試劑盒說明書。

1.8 統計學處理 實驗結果經SPSS 16.0統計軟件分析，對均值進行t檢驗。

2 結果

圖1 正常對照組神經細胞形態(×200)

圖2 缺氧組細胞形態(×200)

圖3 異丙酚(40～80μg/L)和缺氧組神經細胞形態(×200)

圖4 異丙酚(100μg/L)和缺氧組神經細胞形態(×200)

2.1 異丙酚對大鼠胚胎中腦神經細胞形態觀察 由見圖1～圖4，用倒置顯微鏡下觀察活細胞生長情況,對照組細胞形成團簇，突起增長，并借突起彼此連接形成網絡，細胞呈梭形或椎形，核大而圓，有折光性，位于細胞中央，細胞界限清楚。缺氧24h的模型組可見各組神經細胞突起變少或消失，細胞團松散，表現為缺氧損傷狀態。缺氧后加異丙酚組神經細胞形態基本正常，異丙酚對胚胎中腦神經細胞具有明顯保護作用。缺氧24h后細胞集落及細胞數有明顯下降，差異均有統計學意義(P＜0.01)，異丙酚(40、80、100μg/L)對缺氧胚胎中腦神經細胞逐漸增多，差異均有統計學意義(P＜0.05)。

2.2 MTT檢測神經元細胞存活率 由表1可見，MTT測定結果，缺氧模型組與正常對照組比較，OD值均有所下降，差異均有統計學意義(P＜0.01)；異丙酚劑量(20～100μg/L)干預缺氧24h后對神經細胞生存率OD值較模型組均有所增高，差異均有統計學意義 (P＜0.05，P＜0.01)。

表1 異丙酚對神經細胞培養生存率的影響s，n=5)

表1 異丙酚對神經細胞培養生存率的影響s，n=5)

注：與正常對照組相比(*P＜0.05；**P＜0.01)；與缺氧模型組和異丙酚干預組相比，**P＜0.01。

組別 劑量(μg/L) OD值(24h)正常對照組缺氧模型組異丙酚干預組--1 0 20 40 80 100 0.659±0.032 0.4280.053**0.460±0.032 0.491±0.045*0.562±0.024**0.684±0.052**0.596±0.064**

2.3 異丙酚對神經元細胞培養上清液中LDH活力的影響 由表2可見。神經元細胞經缺氧處理后，上清液中的LDH活力增高，與正常對照組相比，差異均有統計學意義 (P＜0.01)；異丙酚組可以顯著降低細胞中LDH活力，差異均有統計學意義(P＜0.05，P＜0.01)。

表2 異丙酚對神經細胞培養上清液中LDH活力的影響(±s，n=5)

表2 異丙酚對神經細胞培養上清液中LDH活力的影響(±s，n=5)

注： 與正常對照組比較，**P＜0.01； 與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 劑量(μg/L) LDH(U/L)正常對照組缺氧模型組異丙酚干預組--1 0 20 40 80 100 78.52±16.26 241.52±14.21**132.32±16.35 134.24±15.84*148.72±13.34**162.34±17.62**151.54±15.64**

2.4 異丙酚對缺氧損傷神經元細胞內SOD活性、MDA及GSH含量的影響

表3 異丙酚對缺氧損傷神經細胞內SOD活性、MDA和GSH 含量的影響±s，n=5)

表3 異丙酚對缺氧損傷神經細胞內SOD活性、MDA和GSH 含量的影響±s，n=5)

注： 與正常對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01； 與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01； 與正常對照組比較，*P＜0.05**P＜0.01； 與模型組比較，*P＜0.05**P＜0.01。

組別 劑量(μg/L)SOD(U/mg prot)MDA(nmol/mg prot)GSH(mg/g ptor)正常對照組缺氧模型異丙酚干預組--1 0 20 40 80 100 87.36±18.35 30.69±11.32**62.54±9.47 60.42±7.42**50.72±5.62**48.35±6.34**42.36±4.33**7.592±0.54 10.52±1.36*4.36±1.25 6.624±1.82*5.941±0.76*6.375±0.92*6.824±0.84*72.72±9.72 92.65±10.53 71.38±9.72 69.37±8.74*52.32±7.54*49.52±6.33*42.64±6.47*

由表3可見。缺氧組與正常對照組比較，細胞內SOD活性顯著下降，差異均有統計學意義 (P＜0.01)，MDA、GSH含量增加，差異均有統計學意義(P＜0.05)；而異丙酚 40～100μg/L 處理組，與缺氧模型組比較均可減少細胞內SOD活性，差異均有統計學意義(P＜0.01)，MDA和GSH含量的產生，差異均有統計學意義(P＜0.05)。

3 討論

氧化損傷是引起缺血再灌注損傷的重要機制之一，在大鼠心臟缺血再灌注過程中，異丙酚輸注能減少MDA含量和提高SOD活性，并呈劑量依賴性，丙二醛(MDA)是氧化損傷過程中脂質過氧化的產物；超氧化物岐化酶(SOD)能清除氧自由基，其活性反映了機體抗氧化損傷的能力[4]，與組織損傷的程度密切相關。異丙酚是一種抗炎劑通常用于全身麻醉、鎮靜在加護病房的病人[5]。臨床上尚未見不良反應，但仍然存在一些不足之處。藥物給藥途徑與劑型方面有待改進，使藥物定位準確具有選擇性的治療作用，從而使受損部位能達到有效濃度，當神經細胞因缺血缺氧受到損傷時，線粒體功能異常，氧化呼吸鏈受損，電子傳遞阻斷，ATP產生減少。琥珀酸脫氫酶是琥珀酸氧化呼吸鏈里重要的復合酶之一，所以，琥珀酸脫氫酶的活性，可以反映神經細胞缺氧損傷的程度。本實驗表明，缺氧損傷模型組比正常對照組吸光度值顯著性降低，結果表明細胞內琥珀酸脫氫酶的活性已經降低，細胞呼吸功能受損，說明缺氧24h可以損害神經細胞代謝能力。乳酸脫氫酶(LDH)的測定來評估和量化細胞死亡[6]，與缺氧損傷模型組比較，異丙酚各劑量組可以顯著提高細胞活性，說明異丙酚能對抗缺氧對神經細胞琥珀酸脫氫酶活性的損害，維持缺氧損傷細胞的呼吸功能。乳酸脫氫酶是參與細胞能量代謝的一個重要的酶。同時產生ATP。缺氧導致細胞急性損傷時，細胞膜完整性遭到破壞，胞通透性增加，LDH將從胞漿中釋放出來，在離體神經細胞培養中可以引起細胞活力的下降，活細胞數目的減少，乳酸脫氫酶(LDH)的釋放增加因此LDH是反映胞膜完整性的重要檢測指標[7]。與缺氧損傷模型組比較，異丙酚各劑量組均可顯著減少缺氧條件神經元細胞LDH的外漏量，一定程度上保持了神經元膜的完整性。在神經元缺血缺氧的同時，活性氧爆發性產生，而組織中清除氧自由基的SOD活性卻降低了，導致氧自由基堆積,使膜脂質過氧化而致細胞損傷當體內有過量的氧自由基時，就會啟動脂質過氧化，產生大量的脂質過氧化物，在導致內源性抗氧化系統的清除能力受損[8]。本實驗結果顯示，缺氧24h的模型組可見各組神經細胞形態，細胞集落及細胞數有明顯下降，突起變少，表現為缺氧損傷狀態。異丙酚可以增強了強抗氧化酶心肌細胞內SOD活性，減少脂質過氧化產物MDA的產生。且隨異丙酚的劑量增高其抑制效應加強。缺氧后加異丙酚組神經細胞形態基本正常當異丙酚劑量在25、50、100μg/L范圍內對缺氧神經細胞逐漸增多作用。說明異丙酚對胚胎中腦神經細胞具有明顯保護作用。

綜上所述，異丙酚可顯著減少缺氧條件神經元LDH的外漏量，一定程度上保持了神經元膜的完整性。另也通過增強神經細胞清除自由基的能力，對抗缺氧導致的細胞膜氧化損傷，對缺氧損傷神經細胞具有明顯的保護作用。并通過內在抗氧化機制恢復和增強了抗氧化酶活性，減輕脂質過氧化反應引起的細胞內損傷。

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