噬菌體生物擴增法直接檢測痰標本中結核分枝桿菌異煙肼耐藥性的研究

邊澤源，楊蕓紅，何 川，涂少華，涂榮躍

(江西省胸科醫院，江西 南昌 330006)

結核病防治面臨的最大困難是耐藥結核菌的流行與傳播；快速準確的一線抗結核藥物耐藥性測定是臨床制定合理化療方案的前提；異煙肼是最主要的一線抗結核藥物之一，還可以作為耐多藥結核病的標志之一。因此，快速準確測定異煙肼耐藥性具有重要意義。

國內外已經利用分枝桿菌噬菌體D29，對臨床分離的結核分枝桿菌菌株進行耐藥性檢測的研究，結果顯示該方法有較高的特異性、敏感性[1，2]。但利用臨床分離菌株進行耐藥性檢測仍需較長時間(3～7周)，沒有真正達到快速檢測的目的。我們應用噬菌體生物擴增法對臨床痰標本直接進行異煙肼耐藥性檢測，測定結果與常規絕對濃度法結果進行比較，以評價PhaB法的臨床應用價值。現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1 .1 待檢痰標本40例，痰涂片陽性：痰檢(1＋)30例，痰檢(2＋)9例，痰檢(3＋)1例。源于我院已確診為肺結核病住院病人、均為臨床擬診為耐藥的肺結核患者。

1.1 .2結核分枝桿菌噬菌體試劑盒 (含液體培養等)(FASTPlaque TBTM)購自上海金浩科技發展有限公司，批號G-0340；生產企業：英國BIOTEC Laboratories ltd公司生產。

1.1 .3抗結核藥液的配制 異煙肼粉末(北京結核病控制中心參比實驗室提供)用蒸餾水溶解成濃度為1mg/ml，-20℃保存備用，使用時用液體培養基將藥物稀釋成 2μg/ml。

1.2 方法

1.2 .1痰標本前處理 取合格痰標本約5ml，加適量4%的氫氧化鈉，反復用玻璃棒攪打液化痰液15min；轉入50ml離心管，加液體培養基至50ml，4000 r/min離心15min，去上清液，沉淀物加入液體培養基洗滌1次，去上清液，沉淀物加入1.0ml液體培養基混勻。上述前處理標本抗酸染色，根據鏡檢結果取 0.3ml適當稀釋：1～10條/(1000×)稀釋 10倍；10～50 條/(1000×)稀釋 100；＞50 條/(1000×)稀釋 1000[3]。

1.2 .2藥物作用標本中的MTB 取上述稀釋標本0.1ml+0.1ml異煙肼+0.8ml液體培養基，無菌條件下轉移至反應管中，37℃孵育48h；對照組，沉淀物加1m l液體培養基，不加藥物，37℃孵育48h。整個過程注意無菌操作。吸取1ml液體培養基加于反應管中，為“陰性對照”；取50μl指示細胞溶液，用液體培養基稀釋106倍，隨后取1ml該稀釋液于反應管中，為“陽性對照”。

1.2 .3噬菌體耐藥測定 噬菌體浸染、終止侵染、澆注平板、結果判斷參照文獻方法[4]。結果判斷標準：(無藥管噬菌斑-藥物作用管噬菌斑)/無藥管噬菌斑＞85%為敏感，反之為耐藥。

1.2 .4 MTB的絕對濃度法藥物敏感性檢測：同時取前處理后標本按中國防癆協會制定的《結核病診斷實驗室檢驗規程》[5]進行MTB的分離培養和異煙肼耐藥性的測定。

2 結果

兩種方法對40份痰標本中MTB異煙肼耐藥性的檢測結果比較(見表1)，PhaB法耐藥23例，敏感17例；絕對濃度法檢測，耐藥28例，敏感12例。以絕對濃度法檢測結果為判斷標準，則PhaB法異煙肼耐藥性檢測的敏感性、特異性、準確性分別是78.57%(22/28)、91.67%(11/12)、82.50%(33/40)。Kappa檢驗，k＝0.63 P=0.00＜0.05，說明 PhaB 法與絕對濃度法檢測結果有較好的一致性。

3 討論

表1 PhaB法與絕對濃度法檢測結果比較

由于結核分枝桿菌生長緩慢，常規藥敏試驗需3～7周或更長時間，不能滿足臨床需要；快速培養儀測定系統盡管可顯著縮短時間，但需特殊儀器設備，價格昂貴；分子生物學檢測技術雖有快速、靈敏的優點，但操作煩瑣、技術要求高，難在臨床常規應用。

PhaB法是一種快速、簡便的測定MTB耐藥性的新方法，是由Wilson等[1]于1997年建立，并用于利福平和異煙肼的耐藥性測定。因與常規的耐藥性檢測結果符合率高，普遍認為這是一種極具發展前景的新方法，使其在結核病的研究中備受關注[6-8]。基本原理是分枝桿菌噬菌體D29既能感染緩慢生長的MTB，又能感染快速生長的恥垢分枝桿菌，因此當藥物與MTB作用一定時間后，耐藥菌能繼續生長，并被隨后加入的噬菌體所感染，而敏感株因被藥物殺死，不能被噬菌體感染，未進入菌體內的噬菌體則被隨后加入的殺毒劑殺死，進入菌體內的噬菌體不受影響，而在菌體內大量繁殖，并將細菌裂解，釋放出的噬菌體可立即感染隨后加入的指示細胞，并使其裂解，由于指示細胞繁殖迅速，所以24h觀察到在培養皿上出現明顯噬菌斑。因此，只要根據噬菌斑的有無及數量的多少即可判斷待檢菌株的耐藥性。

由于MTB生長緩慢，目前多數研究是用臨床已分離菌株進行耐藥性檢測，達不到快速的目的。鑒于國內尚無直接對痰標本中的MTB進行耐藥性檢測研究的報道，我們參照文獻[4]并略作改進，設計建立了直接對痰標本快速測定異煙肼耐藥性的噬菌體生物擴增法。本研究結果表明，PhaB法具有較高的敏感性和特異性，與Shriprakash Kalantri等研究結果相符[9]。

由此可見，噬菌體生物擴增法直接檢測痰標本中異煙肼耐藥性，對及時篩查耐藥肺結核患者有重要的參考價值,該法簡單、快速、不需要特殊儀器設備，4d即可獲得耐藥性測定結果，基本能夠滿足臨床診治需求；而且又有較高的敏感性和特異性，非常適合基層推廣使用。此外，PhaB法將活耐藥結核菌株裂解，對于有效預防、控制耐多藥結核分支桿菌的傳播具有重要意義。

[1]Wilson SM,Al-Suwaidi Z,McNerney R,et al.Evaluation of a new rapid bacteriophage-based method for the drug susceptibilty testing of Mycobacterium tuberculosis[J].NatMed,1997,34:465-468.

[2]王 潔,崔振玲,胡忠義,等.噬菌體法同時檢測四種一線抗結核藥物耐藥性[J].中華傳染病雜志,2006,24(2):102-105.

[3]劉錫光.現代診斷微生物學[M].北京:人民衛生出版社,2002:726.

[4]彭 麗,陳保文,沈小兵,等.噬菌體生物擴增法與改良羅氏比例法在結核桿菌藥敏檢測中的比較[J].中國防癆雜志,2005,27(1):18-22.

[5]中國防癆協會基礎專業委員會編著.結核病診斷實驗室檢驗規程[M].中國教育文化出版社,2006.

[6]Carriere C,Riska P,Zimhony O,et al.Conditional replicating luciferase reporter phages:improved sensitivity for rapid detection and assessment of drug susceptibility ofmycobactetrium tuberculosis[J].J Clin Microbiol,1997,35(12):3232-3239．

[7]胡忠義,倪蓮娣,張瑩蓉,等.噬菌體生物擴增法在分枝桿菌鑒定和藥敏試驗中的應用[J].中國防癆雜志,2003,25(增):63-64.

[8]韓喜琴,高微微,李傳友,等.噬菌體擴增法快速篩選結核分枝桿菌對抗結核藥物敏感性的研究[J].中國防癆雜志,2003,25(增):54.

[9]Kalantri S,PaiM,Pascopella L,et al.Bacteriophage-based tests for the detection of Mycobacterium tuberculosis in clinical specimens:a systematic review and metaanalysis[J]. BMC Infectious Diseases,2005,5:59.