亞砷酸鈉致早期雞胚胚胎發育毒性與基因甲基化的關系

宋 歌 崔 熠 夏紅飛 馬 旭＊

1.北京協和醫學院研究生院(100730);2.國家人口計生委科學技術研究所遺傳優生中心

砷是一種普遍存在的環境污染物[1],砷化合物對胚胎發育毒性機制的研究是近年來的研究熱點。胚胎發育是細胞和組織順次遷移和分化的過程,各種不同類型細胞的細胞周期受到嚴格的調控,保證了各組織器官發育的協調。DNA甲基化狀態可以改變 DNA的結構,影響順式反應元件與轉錄因子的相互作用,進而影響基因的表達[2]。雞胚是一種用于研究胚胎發育過程中重要基因功能的經典模型[3]。砷化合物對雞胚胎有十分強的毒性,可引起胚胎早期死亡、影響胚胎生長發育直至引起畸形[4]。過去認為,砷的甲基化是一種解毒方式[5]和使致癌原失活的過程,近年來的研究則認為,砷在體內的甲基化過程可能對 DNA的甲基化造成干擾,繼而引起致癌原對 DNA的損傷,所以砷的甲基化反應被認為是砷在體內的毒性效應的增強過程[6],目前對于無機砷致胚胎發育毒性與 DNA甲基化之間的關系尚存在很多爭議[7,8]。在本研究以雞胚為動物模型,利用亞砷酸鈉(SA)誘導雞胚發育畸形,分析SA對雞胚基因組 DNA整體甲基化及受甲基化調節的相關基因的影響,通過補充甲基供體膽堿(CHO)進一步研究 SA致雞胚發育畸形與 DNA甲基化的關系。

1 材料和方法

1.1 雞胚處理

所用種雞蛋為北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司生產的白來杭 SPF級種雞蛋。為了模擬雞胚胚胎發育的過程,將雞蛋置于能自動傾斜的空氣流通的孵箱里,孵化溫度 37.8℃,濕度為 60%。雞胚處理操作步驟見參考文獻[9],發育時期見參考文獻[10]。種雞蛋鈍端用打孔器打孔,用一次性無菌注射器于 Hhstage 6、8、12期分別注入 50μl生理鹽水 (CON組 ),50μl(100M)SA(SA組 ),50μl(100μg/μl)SA和 50μl(100μg/μl)膽堿聯合處理(SA+CHO組 ),50μl(100μg/μl)膽堿(CHO組)。收獲 Hhstage 20期(72h)雞胚,根據不同實驗進行相應處理。

1.2 雞胚生存能力檢測

雞胚生存能力間接通過 72h(Hhstage 19～20)雞胚體重和雞胚存活率來檢測,收獲時以心臟跳動為存活。獨立處理 3批,每批 25只雞胚,統計體重和存活率;對 72h雞胚小心剝開蛋殼,挑取心臟跳動的雞胚,剝離胚胎外血管網,胚胎用 Zeiss lumar V 12立體顯微鏡在白光下攝相,觀察雞胚形態學變化。

1.3 5-甲基胞嘧啶(5-mec)免疫熒光檢測

收獲 72h雞胚置于 24孔培養板中,孔內加多聚

甲醛 -20°C固定過夜。第 2天將多聚甲醛換為100%甲醇,4°C過夜。第 3天用 75%、50%、25%梯度甲醇使胚胎復水,用 PBST洗凈。10μg/ml蛋白酶K室溫通透 25min后棄去蛋白酶 K,PBST洗 1次,時間 10min。接著用含 0.1%戊二醛的 4%多聚甲醛進行后固定,再用 PBST洗凈,加 2%山羊血清封閉 30min后加入一抗(5-mec抗體用 PBS稀釋 50倍,每孔 150μl),旋轉搖床上孵育,4℃過夜。第 4天回收一抗,PBST清洗。加入二抗(FITC標記的山羊抗鼠 IgG用 PBS稀釋 50倍),每孔 150μl。旋轉搖床上室溫孵育 2h,棄去二抗,PBST洗。胚胎用Zeiss lumar V 12立體顯微鏡 20×照相,488nm激發熒光,用 Axiovision Rel.4.8軟件分析熒光強度。

1.4 Real-time PCR檢測 bcl2、c-myc、cdkn2a、calb2基因 mRNA表達水平

1.4.1 cDNA合成 各處理組雞胚采用 Trizol試劑提取總 RNA(詳見試劑操作說明),紫外分光光度計測定總 RNA濃度。以總 RNA為模板,以寡核苷酸 Oligo(dT)為引物,按反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄。

1.4.2 熒光定量 PCR 熒光定量 PCR反應體系(20μl)如下,分別用 bcl2、c-myc、cdkn2a、calb2和內參 GAPDH的引物 ：cDNA 1μl,引物 1μl,SYBRGreen real-time PCRMasterMix 12.5μl,ddH2O 5.5μl。用ABI 7000 real-time PCR儀分析雞胚 bcl2、c-myc、cdkn2a、calb2基因 mRNA在不同處理組中的表達情況。熒光定量PCR反應條件為：95℃10min;95℃15s;60℃30s共 40個循環。用 7500 Software v2.0.1軟件測定每一個樣品的 Ct值(cycles threshold),用相對定量法分別分析 bcl2、c-myc、cdkn2a、calb2基因 mRNA的表達水平。以 bcl2基因為例,具體方法如下：先計算每個樣品的ΔCt值,ΔCt=Ct(bcl2)-Ct(GAPDH);以 CON為對照,計算不同樣品與對照的ΔΔCt值,然后再用2-ΔΔCt方法計算各處理組與對照之比的 bcl2基因的相對表達量。

表 1 引物和擴增片段大小

1.5 統計分析

2 結果

2.1 SA及其與 CHO聯合處理對雞胚生存力的影響

如表 2所示,與 CON相比,SA組胚胎存活率和胚胎體重明顯減少(P＜0.01)。AS組與 AS+CHO組相比,CHO組與 CON相比,胚胎存活率和胚胎體重差異均無統計學意義。

2.2 各組雞胚表型

由圖 1可見,SA可誘發雞胚發育畸形,主要表現為體型變小、后腦發育遲緩、小頭等畸形。補充甲基供體 CHO,未明顯改變雞胚的發育異常。與 CON相比,單獨給予 CHO未引起胚胎發育畸形。這些結果提示補充膽堿不能明顯恢復胚胎的發育異常。

表 2 各組雞胚存活率及體重情況(±s)

表 2 各組雞胚存活率及體重情況(±s)

處理組 胚胎存活率 (%)(n=25)胚胎體重 (mg)(n=15)CON 98.67±2.3 19.11±1.8 SA 69.33±8.3 9.62±4.7 SA+CHO 70.66±6.1 9.27±3.4 CHO 92.00±4.0 17.86±3.7

圖1 不同處理組雞胚形態學的變化

2.3 各組雞胚基因組 DNA整體甲基化情況

圖 2 whole-mount免疫熒光檢測 5-mec基因的表達情況

5 -mec含量是基因組 DNA整體甲基化水平的體現。利用全胚的免疫熒光來檢測不同處理組雞胚5-mec的水平。如圖 2、圖 3所示,與 CON相比,SA組 5-mec的含量明顯減少(P＜0.01)。SA組與CHO+SA組相比,CON與 CHO組相比,5-mec的表達無顯著差異,提示補充 CHO不能明顯拮抗砷抑制雞胚基因組 DNA整體甲基化的作用。

2.4 不同處理方式對受甲基化調節基因表達的影響

為了研究雞胚整體甲基化水平改變是否影響基因的表達模式,用熒光定量 PCR來檢測受甲基化調節基因 bcl2、c-myc、cdkn2a和 calb2的表達水平。在利用 real-time PCR檢測不同處理組受甲基化調節基因的表達前,首先檢測了這些基因的溶解曲線和擴增曲線。這些基因的溶解曲線和擴增曲線均較特異,提示當前反應條件下,各基因均可得到很好的擴增。

由圖 4可見,與 CON相比,SA組 bcl2(P＜0.05)和 c-myc的 mRNA水平顯著降低 (P＜0.01),cdkn2a和 calb2mRNA水平沒有明顯變化(P＞0.05)。與 SA組相比,CHO+SA組 bcl-2的表達水平增加(P＜0.01),calb2的表達水平明顯減少(P＜0.05),c-myc和 cdkn2a的表達降低(P＜0.01)。CON與 CHO組 bcl2、c-myc、cdkn2a和calb2的表達水平差異無統計學意義(P＞0.05)。這些結果提示,盡管補充膽堿對砷抑制基因組 DNA整體甲基化水平沒有明顯的補償作用,但在一定程度上可以抑制部分受甲基化調節基因的表達。

圖 4 基因 bcl2、c-myc、cdkn2a和 calb2mRNA表達模式

3 討論

在本研究中,SA能夠顯著降低雞胚體重和存活率,并可誘發雞胚各種發育畸形,主要表現為體型變小、后腦發育遲緩、小頭等畸形。李勇等[11]研究了不同劑量砷誘發大鼠畸胎形成。Hood[12]給小鼠一次腹腔內注射砷酸鈉,引起胚胎死亡,殘存仔鼠體重減輕并出現多種畸形,以露腦為多見。本研究在雞胚組織中的檢測結果與這兩篇文獻在大鼠和小鼠中的報道基本一致。

無機砷在環境和機體內均有甲基化代謝的轉換過程[13],砷暴露是否引起 DNA甲基化模式的改變,進而產生致畸效應,已引起人們極大的關注。本實驗中,SA組雞胚基因組 DNA整體甲基化水平低于對照組,說明砷處理組雞胚基因組 DNA整體甲基化水平降低。這與 Nohara等[14]在小鼠中的研究結果是一致的,砷能夠引起小鼠肝臟整體 DNA甲基化水平減少。此外,為了研究砷誘導的胚胎整體低甲基化與基因表達的關系,我們選擇受甲基化調節,且在砷致胚胎毒性和細胞周期調控中發揮重要作用的基因 bcl2、c-myc、calb2和 cdkn2a[15,16]為研究對象,利用熒光定量 PCR分析這些基因在砷處理雞胚中的表達模式,發現 bcl2和 c-myc表達下調,calb2和 cdkn2a沒有明顯變化,這些結果表明砷誘導的雞胚基因組 DNA整體甲基化水平降低,同時,部分受甲基化調節的基因表達水平也具有下調趨勢。

CHO是一種含豐富甲基的營養物質,做為甲基供體參與體內甲基代謝反應[17]。它能夠影響胚胎發育,動物模型研究結果和人類流行病學研究表明,在妊娠期間補充 CHO對于胎兒中樞神經系統的發育和功能的正常是非常重要的[18]。葉酸的供甲基作用還能夠參與維持 DNA甲基化狀態,影響基因的表達,Ramirez等[19]報道指出葉酸能夠抵抗砷的毒性。因為膽堿和葉酸都是一碳代謝的供體,已有研究證實 CHO缺乏導致基因甲基化的改變,并且間接影響細胞周期調控因子 cdkn、calb2的表達,以此改變胚胎大腦的發育[16];而 CHO能否拮抗砷的毒性還尚未見報道。為了研究 CHO是否可以拮抗砷的胚胎毒性,對 SA處理的雞胚補充 100μg/μl CHO,觀察雞胚生存力和表型及甲基化水平的變化。研究發現,與砷處理組相比,SA和 CHO聯合處理雞胚不能明顯改善雞胚生存力和發育情況,雞胚基因組DNA整體甲基化水平亦沒有明顯變化。檢測受甲基化調節基因的表達發現 c-myc、calb2和 cdkn2a表達水平顯著降低,這些結果提示盡管補充 CHO對砷抑制基因組 DNA整體甲基化水平沒有明顯的補償作用,但可以在砷化物存在時抑制受甲基化調節的基因 c-myc、calb2和 cdkn2a表達,其機制有待進一步研究。

從以上結果可見,砷通過抑制基因組 DNA整體甲基化水平引起雞胚發育異常,同時,部分受甲基化調節的基因表達水平存在反向關系。甲基化供體CHO不能明顯恢復砷所致胚胎異常,但能抑制 cmyc、calb2和 cdkn2a的表達。對砷及其與 CHO聯合處理對雞胚甲基化影響分子機制的深入研究將有助于闡明基因甲基化在 SA致雞胚胚胎毒性中的作用機制。

1 Coppin JF,Qu W,Waalkes MP.Interplay between cellular methyl metabolism and adaptive efflux during oncogenic transformation from chronic arsenic exposure in human cells[J].J Biol Chem,2008,283：19342-19350.

2 Doerfler W.DNA methylation and gene activity[J].Annu Rev Biochem,1983,52：93～ 124.

3 林艷青,耿建國.雞胚早期發育過程中細胞周期調控的研究進展[J].廣東藥學院學報,2010,26(6)：648-652.

4 萬伯健,王長才.亞砷酸鹽對早期雞胚的毒性及其致畸作用的實驗研究[J].環境與健康雜志,1984,1(4)：3-4.

5 蔡林,王革嬌.抗砷性微生物及其抗砷分子機制研究進展[J].微生物學報,2009,36(8)：1253-1259.

6 Thomas DJ,Miroslav S,Shan L.TheCellular Meatbelism and Systemic Toxieity of Aesrnic[J].Toxicol Appl Pharmacol,2001,176(2)：127-144.

7 Zhao CQ,MatthewR,Diwan BA,et al.Association of arsenic-inducedmalignant transformation with DNA hypomethylation and aberrant gene expression[J].Proc Natl Acad Sci USA,1997,94：10907-10912.

8 Mass MJ,Wang L.Arsenic alters cytosinemethylation patterns of the promoter of the tumor suppressor gene p53 in human lung cells：a model for amechanism of carcinogenesis[J].Mutat Res,1997,386(3)：263-277.

9 Rosenquist TH,Ratashak SA,Sehlub J.Homocysteine induces congenital defects of the heart and neural tube：effect of folic acid[J].Proc Natl Acad Sci USA,1996,93：15227-15232.

10 Hamburger V,Ham ilton HL.A series of normal stages in the development of the chick embryo[J].JMorph,1951,88：49-58.

11 李勇,俞在芳.砷誘發細胞凋亡與大鼠畸胎形成的關系研究[J].衛生研究,1998,27(2)：91-94.

12 Hood RD.Developmental effects of methylated arsenic metabolites in mice[J].Bull Environ Contam Toxicol,1998,61(2)：231-238.

13 Vahter M,Marafante E.Intracellular interaction and metabolic fate of arsenite and arsenate inm ice and rabbits[J].Chem Biol Interact,1983,47：29-44.

14 Nohara K,Baba T,Murai H,et al.GlobalDNAmethylation in the mouse liver is affected by methyl deficiency and arsenic in a sexdependentmanner[J].Arch Toxicol.2010Oct 27.http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20978746

15 王文恭,童坦君.細胞凋亡過程中 bcl-2基因的甲基化[J].中國生物化學與分子生物學報,1998,14(3)：309-313.

16 Niculescu MD,Craciunescu CN,Zeisel SH.Dietary choline deficiency altersglobal and gene-specific DNA methylation in the developing hippocampus ofmouse fetal brains[J].The FASEB Journal,2006,20(1)：43-49.

17 Zeisel SH.Dietary choline：Biochem istry,physiology,and pharmacology[J].Annu Rev Nutr,1981,1：95-121.

18 Zeisel SH.Choline：Critical role during fetaldevelopment and dietary requirements in adults[J].Annu Rev Nutr,2006,26：229-250.

19 Ram irez T,Stopper H,Fischer T,etal.S-Adenosyl-L-methionine counteractsm itotic distrbance and cytostatic effects induced by sodium arsenite in HeLa cells[J].Mutat Res,2008,637：152-160.