短時受精并即刻脫顆粒細胞對 IVF-ET治療周期的影響

刁 英 楊智敏 譚兵兵 葛 斌 楊名慧

遵義醫學院第一附屬醫院生殖中心(563003)

與傳統體外受精(精卵孵育過夜)不同,短時受精是將精卵共同孵育 2～4h后,即將卵移出受精滴的一種受精方式,對其常規應用目前仍存在疑義：①短時受精是否會影響受精率與妊娠率;②短時受精并即刻脫顆粒細胞是否增加多原核 PN率等。本研究以在本中心接受體外受精 -胚胎移植(IVF-ET)治療的患者 271例 316個周期為研究對象,探討上述問題。

1 資料與方法

1.1 研究對象

將 2005年 12月 ～2009年 6月在本中心接受

IVF-ET治療的患者271例 316個周期,隨機分成 3組：①短時受精并即刻脫顆粒細胞組(A組,精卵孵育 2h并即刻脫顆粒細胞)92例 110周期,患者年齡30.8±5.1歲,獲卵 10.8±3.5個;②短時受精并次日晨脫顆粒細胞組(B組,精卵孵育 2h并受精后 18～19h脫顆粒細胞)89例,108個周期,患者年齡30.1±4.9歲,獲卵 11.1±4.0個;③傳統受精組(C組,精卵孵育過夜)90例,98個周期,患者年齡 31.2±4.5歲,獲卵 10.5±3.8個。以上數據經統計學分析,3組間差異無統計學意義(P＞0.05)。

1.2 方法

1.2.1 控制性超促排卵及取卵 根據患者年齡、卵巢儲備情況選擇不同的方案。①長方案：采用本中心常規超排卵方案[1],當有 1個卵泡直徑≥18mm,或 2個以上卵泡直徑≥17mm時,當晚 9時注射人絨毛膜促性腺激素(hCG)5 000～10 000U,36h后在B超引導下陰道取卵。②短方案：在月經周期第 2天采用短效曲普瑞林(達必佳)0.1mg降調節,第 3天用卵泡刺激素(FSH)/人絕經促性腺激素(HMG)啟動 ,根據患者年齡、卵巢儲備情況,選擇不同啟動劑量,常規啟動劑量為 150～225U,根據卵泡生長情況適時調整藥量。注射 hCG時間與取卵同長方案。

1.2.2 精液準備 手淫法取精于一次性無菌廣口杯中,根據精液當日情況用密度梯度離心和(或)上游法[2]洗精,置 37℃,5%CO2培養箱中備用。

1.2.3 受精及脫顆粒細胞時間和胚胎培養 取卵4～6h后,按精卵(20 000～50 000)：1比例混合法受精。A組：精卵共同孵育 2h后,即脫去卵周圍全部顆粒細胞,將卵轉移至新鮮的已平衡過的受精培養液中;B組：精卵共孵育 2h后,將卵連同周圍顆粒細胞轉移至新鮮已平衡過的受精培養液中,第 2天(精卵共同孵育 18～19h)去掉卵周圍的顆粒細胞;C組：精卵共同孵育過夜(精卵共同孵育 18～19h),第2天去掉卵周圍顆粒細胞。3組卵均于受精 18～19h后轉入卵裂培養基中,在倒置顯微鏡下觀察受精情況。受精卵繼續培養 48h,觀察胚胎發育情況,然后選擇優質胚胎進行移植。第 3日評價胚胎質量根據參考文獻[3]的標準進行。胚胎達 6細胞以上,Ⅰ ～Ⅱ級胚胎為優質胚胎。

1.2.4 胚胎選擇與移植后處理 取卵后第 3天進行胚胎移植?；颊吣挲g ＜35歲,移植 2個胚胎;年齡 ＞35歲,或≥2個治療周期,移植 3個胚胎。移植后予黃體酮或 hCG支持黃體。移植后 2周測尿hCG,陽性者為生化妊娠。移植后 5周,B超檢查見孕囊及胚芽即診斷為臨床妊娠。

1.3 統計學方法

3組計量資料采用方差分析,計數資料采用 χ2檢驗。

2 結果

2.1 受精率、多精受精率、卵裂率和優質胚胎率的比較

A組 110個周期共獲卵 1 188個;B組 108個周期,共獲卵 1 198個;C組 98個周期,共獲卵 1 029個。3組相比較,受精率、多精受精率、卵裂率差異無統計學意義(P＞0.05)。優質胚胎率 A組、B組均高于 C組(P＜0.01),A組與 B組相比差異無統計學意義(P＞0.05),見表 1。

2.2 臨床妊娠率、胚胎種植率、流產率的比較

A組和 B組的臨床妊娠率、胚胎種植率均顯著高于 C組(P＜0.05,P＜0.01),A組與 B組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。流產率各組間差異無統計學意義(P＞0.05),見表 1。

表 1 3組 IVF-ET各項數據比較

2.3 3組分娩結局

3組出生嬰兒男女性別比例、單胎出生體重及多胎出生體重比較差異均無統計學意義(P＞0.05),見表 2。3組均未見畸形新生兒出生,亦無圍生期死亡病例。

3 討論

目前,IVF-ET是治療不育癥最有效的方法之一,但成功率尚不盡如人意。與體內受精時到達受精部位的精子數量有限(幾條 ～幾百條不等)不同,體外受精時將卵子暴露于較高濃度的精子中(20 000～50 000)長達十多個小時,是否會對卵及其隨后的胚胎發育產生不良影響?基于此點考慮,1996年 Gianaroli等[4]在前人 Austin[5]及 Yanagimachi[6]等動物實驗的基礎上,首次將精卵孵育時間縮短至 1h,取得了較好的結果。之后又有 Kattera等[7]及 Bungum等[8]等證實了這一結果。本研究結果亦顯示：短時受精無論是即時脫顆粒細胞組還是次日晨脫顆粒細胞組,其受精率、卵裂率、流產率與傳統受精組比較,差異均無統計學意義,而優質胚胎率、臨床妊娠率、胚胎種植率高于后者,究其原因可能有以下幾點：①體內受精時精卵相互作用和受精發生在性交后 20min內。Gianaroli等[9]發現：在體外,精子 4h就可以到達卵母細胞的皮質,相互激活,刺激卵母細胞排出第 2極體,形成雌雄原核。Bungum等[8]將受精時間縮短到極致(僅 30s),發現與傳統受精比較受精率無明顯差異;而李濤等[10]采用精卵孵育 10min的超短時受精,也獲得了 65.6%的正常受精率。本研究結果進一步證明：精卵孵育 2h完全能夠滿足受精所需時間。②傳統受精組卵子與高密度精子長時間作用,精子代謝產物堆積,加之脫落的顆粒細胞及死精子等均會消耗培養液的能量,使卵處于一個營養不良的環境中。另外,顆粒細胞、精子代謝產生的活性氧化物(ROS)可造成不飽和脂肪酸發生過氧化反應,影響卵質膜的流動性,導致卵質膜硬度的變化,這一變化可能影響細胞分裂和損傷細胞功能[4,9]。而且來源于精子的乳酸鹽和 ROS不但對精卵作用產生負面影響,同時也影響透明帶的硬度與厚度[11],從而影響胚胎的孵育與著床,最終影響到 IVF-ET的結局。

表 2 3組分娩結局比較

短時受精并即刻脫顆粒細胞與傳統受精方式比較,除了可以提高優質胚胎率、臨床妊娠率和胚胎種植率外,還有以下優點：①受精 2h脫顆粒細胞后,可以清楚地看見卵是否排出第 1極體,卵周間隙的大小及卵胞漿有無空泡等,從而可以反饋指導臨床注射 hCG的時機是否合適。與此同時筆者還發現：一些取卵當日(受精后 2h)脫顆粒細胞時為 MⅠ或 GⅤ的卵,次晨可長成 MⅡ(或 MⅠ)的卵卻多不受精,從而解釋了以前受精后 18～19h觀察,部分 MⅡ期卵子未受精的原因之一是因為受精當時卵不成熟。即在短時受精并即刻脫顆粒細胞過程中,可以觀察到卵不成熟或過成熟對受精率和多精受精率的影響。②由于短時受精并即刻脫顆粒細胞后還可以觀察到第 2極體的排出,從而可明確是否需行早期補救 ICSI治療,以避免完全受精失敗的發生。短時受精并即刻脫顆粒細胞及早期補救 ICSI的使用,將ICSI的指征限定在了無精子癥(采用附睪/睪丸精子)、100%圓頭精子和嚴重卵子異常等情況,因而進一步嚴格控制了 ICSI治療的適應證[12]。

有學者提出：在受精早期脫顆粒細胞的機械操作是否會增加多精受精[13],為此本研究將患者分成了短時受精 2h后即刻脫顆粒細胞與短時受精 2h后,18～19h脫顆粒細胞兩組,分別與傳統受精組進行比較觀察,結果發現 3組多精受精率沒有差異。可能原因如下：①筆者采用的是直徑為 135～140μm的撥卵針,該針管口光滑,彈性較大,大小適宜,僅需幾次輕柔地吹吸就能很快脫盡顆粒細胞,對卵的影響較小,估計還不至達到引起卵受精異常的程度。②多精受精最主要的原因還在于精子數量過多和受精卵子本身的質量問題(不成熟或過成熟)[14,15],質量好的卵經此操作可能不受影響,而質量差的卵雖經如此輕柔的操作仍可能出現異常受精,但也借此淘汰了質量不好的卵形成的胚胎。故筆者認為：只要超排卵方案得當,卵質量好,所加精子密度不過高,短時受精并即刻脫顆粒細胞并不會顯著增加多精受精率;反之,即使不做短時受精并即刻脫顆粒細胞,多精受精率同樣不會低,這在年齡較大或卵募集較多的患者中尤為明顯[16,17]。

綜上所述,筆者認為：短時受精并即刻脫顆粒細胞與傳統受精方式比較,不失為一種有益的改進,且可以幫助臨床判斷注射 hCG的時機是否合適,還使早期補救 ICSI技術成為可能,使 ICSI治療的適應證被進一步嚴格控制。本中心開展此項工作 4年多來,臨床妊娠流產率與傳統組比較并未增多,亦無畸形新生兒出生,出生男女嬰兒性別比例,單胎、多胎新生兒出生體重與傳統組比較亦無差異,故認為此項技術安全有效,值得臨床應用。

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