膽汁中端粒酶逆轉錄酶和Bcl-2基因的表達及意義

夏 偉,柳 詠

(江蘇省揚州市第一人民醫院肝膽外科,江蘇揚州,225000)

膽管癌是一種起源于膽管上皮細胞的惡性腫瘤,目前外科手術及放化療的療效均欠佳,根治術后5年生存率僅0～30%[1],對其病因及早期診斷治療的研究逐漸成為熱點,有研究表明[2],氧化損傷、癌基因激活和減弱的細胞凋亡在發病中起作用。端粒酶可阻止端粒縮短,進而阻止細胞凋亡,與惡性腫瘤的發生密切相關,Bcl-2是一種有抑制細胞凋亡的癌基因,也與惡性腫瘤的發生密切相關。本實驗意欲研究:①膽汁中端粒酶逆轉錄酶及Bcl-2基因的表達,明確其在膽管癌的早期診斷中的意義,并對2者的診斷意義加〗以比較;②探討端粒酶逆轉錄酶和Bcl-2基因在造成膽管癌發生發展中的關系,現報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象

40例膽汁標本取自于本院2008年2月～2010年9月膽管癌及膽總管結石住院患者。膽總管結石膽汁標本20例取自20例膽總管結石患者,在行ERCP取石過程中通過內鏡取得;膽管癌膽汁標本20例取自20例膽管癌患者,在行ER2 CP支架置入術中通過內鏡取得。膽管癌患者中肝門部膽管癌13例,膽總管中下段癌7例;10例獲得手術的膽管癌患者中,按國際抗癌協會UICC標準分期:Ⅰ期0例,Ⅱ期4例,Ⅲ期5例,Ⅳ期1例,Ⅴ期0例。20例膽總管結石患者膽汁標本作為對照組,20例膽管癌患者膽汁標本作為試驗組,2組患者一般資料差異無統計學意義,具有可比性。

圖1 hTERT基因擴增后電泳結果圖(263bp長度為hTERT基因。327bp長度為內對照,標尺為DL2000)

圖2 Bcl-2基因擴增后電泳結果圖(176bp長度為Bcl-2基因。327bp長度為內對照,標尺為DL2000)

1.2 研究方法

首先提取膽汁標本中的總RNA(總RNA抽提試劑盒,華美生物工程有限公司),用逆轉錄試劑盒(ImPom-ⅡTM,Promega公司)合成cD2 NA,然后進行聚合酶鏈式反應(PCR),所用Bcl-2擴增引物:上游引物:5′-GCATCTTCTC2 CTCGCAGCCC-3′,下游引物:5′-CACCAC2 CGTGGCAAAGCGTC-3′。所用端粒酶hTERT擴增引物:上游引物:5′-ACGGCGACATGGA2 GAACAA-3′,下游引物:5′-CACTGTCTTC2 CGCAAGTTCAC-3′。內對照β-actin引物:上游引物:5′-GATGGCCAGGTCATCACCATTG GC-3′,下游引物:5′-GAAGGTGGACAGT2 GAGGCCAGGAT-3′。擴增引物由上海捷倍思生物工程技術服務有限公司合成。最后將目的基因擴增產物進行電泳并進行半定量分析。

2 結 果

2.1 膽管癌患者膽汁中hTERT與Bcl-2基因的擴增電泳結果

膽管癌患者膽汁hTERT與Bcl-2基因擴增結果見圖1、圖2。

2.2 hTERT與Bcl-2基因的表達結果

以電泳后出現目的基因電泳條帶為陽性標準。膽管癌患者膽汁中的hTERT基因陽性(14/ 20),基因相對水平(0.326±0.185),而膽總管結石患者膽汁中hTERT基因無陽性表達,基因相對水平為(0.021±0.014),2組比較,差異有統計學意義(P<0.01)。膽管癌患者膽汁中Bcl-2基因的陽性率(11/20),基因相對水平(0.284± 0.156),膽總管結石患者膽汁中Bcl-2基因的陽性(1/20),基因表達相對水平為(0.027±0. 019),2組比較,差異有統計學意義(P<0.01)。見表1。

表1 端粒酶、Bcl-2在膽管癌和膽管良性病變中膽汁中的表達(n)

2.3 hTERT與Bcl-2基因的相關性

在20例膽管癌患者膽汁標本中,端粒酶與Bcl-2的關系見表2。14例表達hTERT基因陽性的膽管癌膽汁中,Bcl-2基因同時有陽性表達的有9例,6例hTERT基因陰性的膽汁中Bcl-2基因也為陰性的有4例,2者之間無相關性。

3 討 論

端粒酶激活,端粒延長是大多數腫瘤發生的共同事件,已被公認為腫瘤發生發展的機制之一。研究發現,端粒酶逆轉錄酶(hTERT)是端粒酶活性高低的限速決定因子,只有hTERT的表達與端粒酶活性密切相關,近來陸續有報道[3-5]采用RT-PCR方法對人體某些惡性腫瘤包括頭頸部癌、肝癌、泌尿上皮癌、腸癌及乳腺癌等標本進行hTERT基因表達檢測,結果均顯示腫瘤組織的hTERT基因表達量均顯著高于正常組織和良性病變組織。本實驗采用膽汁標本檢測端粒酶逆轉錄酶基因表達,結果表明膽管癌基因高表達,表達陽性率70%,膽總管結石患者膽汁hTERT無表達,本實驗是檢測通過無創手段所采集的膽汁,結果如上,膽管癌患者膽汁中hTERT基因的表達高達(14/20),而膽總管結石患者膽汁中無hTERT基因表達,差異顯著,說明對于膽管狹窄性質不明通過檢測膽汁中hTERT基因的表達可對定性判斷提供幫助。況且通過內鏡收取膽汁是無創手段,并可同時對需要減黃者做內外引流處理,證實通過RT-PCR方法檢測膽汁中hTERT基因可成為診斷膽管癌的一種可取的方式,可作為影像學檢查和活檢等的補充手段,進一步提高膽管癌的診斷水平。

國內資料顯示[6],Bcl-2基因在乳腺癌中的表達顯著高于正常乳腺組織。關于Bcl-2于膽管癌的關系也逐漸被認識。細胞凋亡障礙(尤其是Bcl-2凋亡途徑異常)在膽管癌發生和發展中的作用已開始受到關注,國外學者對肝膽及其腫瘤Bcl-2表達的免疫組化研究顯示[7],肝內膽小管和小膽管上皮Bcl-2蛋白表達陽性,肝細胞、肝內大肝管及肝外膽道均為陰性,72.7%(8/11)的膽管癌表達陽性,肝轉移性腺癌陽性率為42. 8%(6/14)。15例肝細胞癌均為陰性,提出膽管細胞是肝膽祖細胞、Bcl-2蛋白表達是膽管癌的特征性標志。本試驗通過檢測到膽管癌患者膽汁中Bcl-2基因陽性表達(11/20),顯著高于膽總管結石組(1/20),說明Bcl-2的過度表達可能在膽管癌的發生中起一定作用。本實驗通過無創手段所采集的膽汁,膽管癌患者膽汁中Bcl-2的表達高于膽總管結石者,差異顯著,說明對膽管狹窄無法明確性質的患者,通過檢測膽汁中Bcl-2可對定性診斷提供一定幫助。

由上可知,端粒酶通過阻止端粒縮短進而阻止細胞凋亡,從而于惡性腫瘤密切相關,Bcl-2通過多種途徑抑制細胞凋亡,也與惡性腫瘤密切相關,但在腫瘤的發生過程中兩者的相互關系如何,文獻少有報道。有研究認為[8],單純Bcl-2的過度表達可激活端粒酶。膽管癌的發生發展中2者的關系如何尚未見報道。本試驗通過對每份膽管癌患者膽汁同時檢測hTERT基因和Bcl-2基因,以尋求兩者間的關系,結果顯示兩者無明顯相關的關系,其他腫瘤相關基因的作用還待進一步研究。

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