細胞信號轉導通路與動脈粥樣硬化的研究進展

楊雪佳 王高頻 (遼寧醫學院附屬第一醫院心內科,遼寧 錦州 121001)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是由單核/淋巴細胞黏附并激活內皮細胞(EC)而開啟的由多種原因導致的疾病〔1〕,是冠狀動脈疾病、周圍動脈疾病、腦梗死等血管性疾病的病理基礎。不同細胞因子發揮生物學功能均是通過與細胞膜表面受體相互作用,經過跨膜信號轉導活化細胞內的相關信號通路,最終促進靶基因的表達。介導細胞因子生物學活性的信號通路在 AS的發生、發展中具有重要作用,目前人們已經對 AS形成中的相關信號通路的作用進行了廣泛研究,并針對相關信號通路而采取的新型治療方法取得了重大的進展。

1 炎癥相關信號通路與AS

在 AS病變發生發展過程中,從脂質條紋到纖維斑塊和粥樣斑塊,乃至不穩定斑塊的形成和破裂,始終都有各種炎癥細胞和大量的炎癥介質參與,存在變質、滲出和增生。各種危險因素損傷血管內皮,上調產生單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)和巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF),趨化募集并增殖單核/巨噬細胞。同時分泌的各種細胞黏附分子促進血小板、粒細胞、單核細胞等黏附于血管內皮,釋放多種生物活性因子,觸發啟動炎癥反應,促成 AS病變的發生和發展。核轉錄因子-κB(NF-κB)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)及 Janus激酶-信號轉導轉錄激活因子(JAK-STAT)是細胞內 3條重要信號通路。

1.1 NF-κB信號通路 NF-κB是由 Rel蛋白家族的成員以同源或異二聚體形式組成。目前發現的哺乳動物的 Rel蛋白包括 Rel A(p65、NF-κB3)、Rel(c-Rel)、RelB、NF-κB1(p50)和 NF-κB2(p 52),結構上它們的 N端都具有一個由 300個氨基酸組成的Rel同源區,該區域含有二聚體化區,DNA結合區和核定位信號區,分別具有與同源或異源亞基形成二聚體、與DNA上的 κB序列結合、與 κB抑制蛋白(IκB)家族成員相互結合等功能。NF-κB是促炎細胞因子激活細胞的主要信號通路之一。靜息狀態下,NF-κB的 p65亞基與 IκB單體結合形成的三聚體復合物以失活狀態存在于細胞質中,不具有調節基因轉錄的能力〔2,3〕。當細胞受到如應激、病原體、細胞因子、生長因子等的作用時,①IκB激酶(IKK)α/β/γ復合物被 MAPK家族,及非典型蛋白激酶(aPKC)和蛋白激酶 B(Akt)激活;②IκB在酪蛋白激酶 II的作用下磷酸化,其 C末端富含脯氨酸(P)、谷氨酸(E)、絲氨酸(S)及蘇氨酸(T)(PEST)結構域,然后對 IκBαN端的 32和 36位的絲氨酸進行磷酸化;③IκB N端第 21和 22位賴氨酸與多個泛素分子共價結合;④與泛素結合的IκB發生構象改變被多催化性 ATP依賴性 26S的蛋白酶識別并降解,NF-κB游離并移入核內,啟動相關基因的轉錄。由于 NF-κB與IκB親和力大于與其 DNA的親和力,在核內與新合成的 IκB結合,使其從 DNA上解離下來,然后在 IκB分子中的核輸出序列作用下促使 NF-κB重新回到細胞質中〔4〕。 NF-κB活化與失活的循環調控,維持了細胞內環境穩定。

研究發現,活化的 NF-κB存在于AS病灶的平滑肌細胞(SMC)、巨噬細胞、EC等多種細胞中。這條通路激活后可以調節編碼促炎細胞因子、黏附分子、趨化因子、生長因子以及環氧合酶-2(COX-2)和誘導型一氧化氮合酶(NOS)等基因的表達。通過大規模的臨床研究表明,在NF-κB高度表達的主動脈 AS患者中,主動脈處于超炎癥狀態。因此,NF-κB高度表達的診斷參數提供了一種炎癥依據,證明可能導致AS〔5〕。給予低密度脂蛋白受體基因(LDLR-/-)小鼠高脂飲食后,研究者們早期即可在其主動脈根部發現內皮細胞內 NF-κB的活化,而該部位在接下來的觀察中將發展成為 AS斑塊〔6〕。Edwin Kanters等研究發現同樣給予高脂飲食,利用新型的鼠單克隆抗體,在NF-κB1表達缺陷的小鼠比對照組 AS的發生率低〔7〕。

1.2 MAPK細胞內信號轉導通路 MAPK是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,它廣泛存在于體內大多數細胞內,對細胞的增殖、分化、凋亡及應激反應具有至關重要的作用。真核細胞中,已確定出細胞外信號調節激酶(ERK)(P42/P44MARK)通路、應激活化蛋白激酶(SAPK)/JNK通路、P38MAPK通路及 ERK5通路 4條MAPK信號轉導通路。其中 ERK1/2通路可被多肽生長因子和佛波酯激活,對機械刺激也可作出反應。JNK和P38通路對生長因子和佛波酯反應微弱,但對炎癥因子,應激刺激如高溫、滲透壓變化、紫外線、DNA損傷劑和蛋白合成抑制劑反應強烈,因此又被稱為 SAPK。已知ERK5通路可被生長因子、氧化應激、高滲刺激等因素激活,但對其上游的信號分子及其激活后產生的生物學效應不是很清楚。這 4條通路在胞內都是經 MAPKKK,MAPKK和MAPK3級級聯反應將信號傳至核內,作用于特定的靶基因,發揮生物學效應。

有實驗表明,與載脂蛋白 E-/-小鼠比較,JNK 2缺失的載脂蛋白 E-/-小鼠 AS損害明顯減少。將載脂蛋白 E-/-JNK 2-/-小鼠的骨髓移植到載脂蛋白 E-/-小鼠體內時,該小鼠的 AS損傷將一定程度減輕〔8〕。Lu等發現 MAPK信號通路的下游盤狀結構域(DDR)1受體,在AS血管損傷的平滑肌細胞中表達增加,I型膠原誘導 SMC遷移是通過 DDR1受體信號介導的〔9〕。有實驗證明褪黑素能降低由氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)誘導的高脂血癥模型人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)中 MLCK的表達與活性,可能與信號調節通過ERK/MAPK信號轉導通路降低了 AS斑塊形成相關〔10〕。

1.3 JAK-STAT和轉導子信號通路 JAK是一類非受體型酪氨酸激酶,由 4個成員組成:JAK 1、JAK2、TYK2和 JAK 3。前 3者廣泛存在于各種組織和細胞中,而JAK3僅存在于骨髓和淋巴系統。它們分別參與干擾素 α、β、γ和白細胞介素 3～6、粒-巨細胞集落刺激因子等細胞因子的信號轉導過程,具有高度的保守性,是一條細胞因子對免疫反應、血細胞生成、神經和胚胎發育的調節以及細胞增殖凋亡等多效性的傳導通路〔11〕。JAK的酪氨酸磷酸化底物是STATs家族成員。在哺乳動物細胞中,STATs家族可以分為七個亞型 STATl、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b和 STAT6〔12〕。 STAT的 C末端轉錄激活結構域在各個亞型中存在著較大的差異,這與不同類型的細胞因子激活下游不同亞型的 STAT從而激活不同基因有關〔13〕。

STAT3作為 JAK/STAT信號轉導途徑中的一個重要的信號分子,IL-6可以結合 IL-6受體的 α-鏈和糖蛋白 130(GB 130),而后激活 JAK1和 STAT3。干擾素(IFN)-α激活JAK1和 JAK2后通常再激活 STAT蛋白〔14〕。 IFN-γ是一種免疫調節和抗菌因子,Hao等〔15〕研究表明,IFN-γ可以使 ABCA 1表達增多,可能首先是通過JAK/STAT1信號傳導途徑上調肝X受體-α表達,并降低膽固醇,從而減少 AS發生中泡沫細胞的形成。Ievy和 Granot〔16〕報道,STAT3通過直接對早期反應基因的轉錄激活,從而調控 VSMC中增殖信號的傳遞,而大鼠頸動脈球囊損傷后早期即出現 JAK 2及 STAT3的誘導性增高,并在術后 7 d達到峰值。

2 泛素-蛋白酶體通路(ubiquitin-proteasome system,UPS)與 AS

UPS廣泛存在于真核生物細胞中,由泛素(Ub)、泛素活化酶(E1)、泛素耦聯酶(E2s)、泛素-蛋白連接酶(E3s)、26 S蛋白酶體以及泛素再循環酶等組成〔17〕。UPS是 ATP依賴性的,非溶酶體蛋白質的降解通路,不僅降解變性、異常或起短暫作用的蛋白質,而且能降解轉錄因子、內膜蛋白和細胞周期蛋白等天然蛋白質。UPS在維持蛋白質穩定狀態、調節細胞程序性死亡和控制細胞周期等過程中起重要作用。研究發現,細胞內80%～90%的蛋白質是由UPS來降解的,因此,UPS被認為是細胞內蛋白質降解的主要通路,對維持細胞及整個生物體的正常功能,起著重要的作用〔18〕。

Herrmann等〔19〕發現急性冠狀動脈綜合征患者不穩定斑塊內泛素與 T細胞共同表達,影響后者功能,參與炎癥反應并改變斑塊穩定性。泛素耦聯酶-9參與 Fas下游信號轉導并介導細胞凋亡。Marfella等〔20〕發現晨起血壓對 AS穩定性的影響是通過 UPS發揮作用。Marfella等〔21〕還發現 AS患者泛素水平升高但蛋白酶活性減低,UPS功能減低促進細胞老化,加速 AS進程。Yamada等〔22〕對進行過主動脈及二尖瓣手術的 60名患者(平均年齡 64.5歲)進行調查分析,Ub和巨噬細胞易出現在有瓣膜疾病患者的心瓣膜上,而且UPS還可以通過炎性過程以促進 AS的發生。

3 Wnt信號通路與AS

Wnt蛋白是一組富含半胱氨酸的糖基化蛋白,參與細胞的增殖、分化、凋亡以及控制細胞的定位等過程,而且在無脊椎和脊椎動物心臟發育過程中也起到關鍵作用。在胚胎發育期,Wnt信號的失調將會導致夭折或發育缺陷,在成體中則會導致包括癌癥在內的多種疾病的發生〔23〕。

Wnt信號通路是一條繁雜的信號網絡,目前的研究認為至少有 3個分支:①經典 Wnt通路;②Wnt/細胞信號極性(PCP)通路;③Wnt/鈣離子通路。在一項對阻止AS進展策略研究中,證實經典 Wnt信號通路增強單核-內皮細胞粘附而沒有改變粘附分子的表達水平〔24〕。周細胞(pericytes)是主要的內皮支持細胞〔25〕,緊靠 EC,它有調控 EC的成熟、穩定微血管壁及促進新生血管和血管出芽等功能。周細胞沿著脂肪生成、軟骨生成和骨生成方向的異常分化與AS和血管鈣化有關。Wnt信號抑制周細胞向脂肪系分化而促進其向軟骨系分化。提示 Wnt信號通路可能與 AS的發生有關〔26〕。研究者已在載脂蛋白 E基因缺陷小鼠和接受動脈內膜切除術的病人的頸動脈內膜下發現大量 Wnt5a在巨噬細胞積累的區域,同時也發現了大量 Toll樣受體 4(TLR-4)。定量 RT-PCR檢測顯示,內毒素脂多糖(LPS)(已知的TLR-4配體誘發)刺激某種巨噬細胞而使 Wnt5a的mRNA表達。這些都證明Wnt5a在人類和小鼠AS病變中有表達〔27〕。

4 Rho/Rho激酶信號通路與AS

早在 1985年,Rho被確認為是 Ras的哺乳動物基因同系物并因此而得名(Ras homologue)。它廣泛分布于哺乳動物的組織細胞中,被稱為小G蛋白超家族,并因具有 GTP酶活性,又稱為 RhoGTP酶,是目前研究最為詳細的 Ras相關單體 GTP酶。RhoGTP酶有與 GDP結合或 GTP結合的兩種失活或激活狀態,前者定位在細胞漿內,而后者與細胞膜相結合,在細胞的信號轉導通路中作為信號轉換器或分子開關,作用于細胞骨架或其靶蛋白而產生多種生物效應。

現已證實 Rho的下游靶效應分子有 70多個,Rho激酶(ROCK)是其最主要和最直接的效應分子,ROCK又稱Rho相關激酶,屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,是目前功能研究最為詳細的Rho下游靶效應分子。ROCK參與 AS發病機制的途徑如下:①促進單核細胞內皮下遷移:在單核細胞穿越內皮細胞層的遷移過程中,需要發生形態及黏附力的變化。ROCK主要減弱單核細胞尾部整合蛋白調節的黏附力,從而促進胞尾收縮及增強穿越內皮細胞的能力〔28〕。②促進纖溶酶原激活劑抑制物-1(PAI-1)的表達:在鼠離體平滑肌細胞實驗中,抑制 ROCK的活性可完全抑制 AS誘導的平滑肌細胞 PAI-1mRNA的表達,但并不影響 ERK的激活。ROCK可能通過活化轉錄因子,包括活化蛋白-1及血清反應因子等來調節 PAI-1的表達〔29〕。③ROCK增強 EC的通透性:應用ROCK抑制劑 Y-27632,可明顯抑制 EC的通透性。ox-LDL,溶血磷脂酸,凝血酶激活 ROCK,因而抑制了肌球蛋白磷酸化酶的活性,增加了肌球蛋白輕鏈(MLC)的磷酸化,導致 EC收縮,通透性增加〔30〕。④ROCK促進SMC增殖:血管中膜SMC遷移與增生是 AS的基本病理改變之一。ROCK參與凝血酶誘導的SMC的 DNA的合成及遷移〔31〕。ROCK也參與hu-2誘導的血管 SMC增生〔32〕。這種作用可能是通過向下調節細胞周期蛋白依賴的激酶抑制劑P27KIP1而實現的。

ROCK參與的SMC對Ca2+增敏的調節在平滑肌收縮中占主要地位。其機制可能為 Rho活化 ROCK,ROCK抑制肌球蛋白磷酸化酶的活性,提高了磷酸化的肌球蛋白輕鏈(MLCK)磷酸化水平,使平滑肌收縮,導致冠狀動脈痙攣。Mori-Kawabe等〔33〕發現異丙腎上腺素可以使 apoE基因敲除小鼠的內皮完整的主動脈強烈收縮,Y-27632可以更有效地降低了 apoE基因敲除小鼠的收縮性,這提示AS形成早期的平滑肌收縮更多的依賴于 ROCK活性,與 Rho/ROCK系統有重要聯系。ROCK參與如平滑肌收縮,細胞遷移和增殖的多種細胞功能。在過去幾年中,Zhou等〔34〕研究證實,他汀類藥物可通過抑制 ROCKs及其下游目標 Rho激酶而對血管起保護作用,減輕血管的炎性反應,并通過對 AS的“多效性”以減緩 AS的發生。

5 展 望

細胞信號轉導通路的研究是探討人類疾病機制最富有成果的領域,多項試驗證明AS有復雜的炎癥病理生理基礎,最近幾年,在闡明AS的細胞內信號轉導機制方面取得了很大進展。但是各種信號通路詳細機制尚有待進一步研究。細胞因子在AS的臨床早期診斷、血管事件風險評估、治療中的應用已初現端倪,而靶向于細胞因子及細胞內信號轉導的抗 AS治療方法直接針對疾病的慢性炎癥本質,因而具有良好的應用前景。

1 Libby P.Inflammation in atherosclerosis〔J〕.Nature,2002;420(6917):868-74.

2 Baldwin ASJr.The NF-κB and IκB proteins:new discoveries and insights〔J〕.Ann Rev lmmunol,1996;14(4):649-83.

3 Bohrer H,Qiu F,Zimmermann T,et al.Role of NF-κB in the mortality of sepsis〔J〕.J Clin Invest,1997;100(5):972-85.

4 Brasier AR.The NF-kappaB regulatory network〔J〕.Cardiovasc Toxicaol,2006;6(2):111-30.

5 Zhang W,Xing SS,Sun XL,et al.Overexpression of activated nuclear factor-kappa B in aorta of patients with coronary atherosclerosis〔J〕.Clin Cardiol,2009;32(12):42-7.

6 Hajra L,Evans AI,Chen M,et al.The NF-κB signal transduction pathway in aortic endothelial cells is primed for activation in regions predisposed to atherosclerotic lesion formation〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,2000;97(16):9052-7.

7 Kanters E,Gijbels MJ,van der Made I,et al.Hematopoietic NF-kappaB1 deficiency results in small atherosclerotic lesions with an inflammatory phenotype〔J〕.Blood,2004;103(3):934-40.

8 Ricci R,Sumara G,Sumara I,et al.Requirement of JNK2 for scavenger receptor A-mediated foam cell formation in atherogenesis〔J〕.Science,2004;306(5701):1558-61.

9 Lu KK,Trcka D,Bendeck MP.Collagen stimulates discoidin domain receptor 1-mediated migration of smooth muscle cells through Src〔J〕.Cardiovasc Pathol,2010:19.

10 程筱雯,朱華慶,江志奎,等.褪黑素通過 ERK/MAPK通路調控AS兔動脈內皮細胞 MLCK表達〔J〕.中國藥學雜志,2009;44(17):1301-5.

11 Foshay K,Rodriguez G,Hoel B,et al.JAK2/STAT3 directs cardiomyogenesis within murine embryonic stem cells in vitro〔J〕.Stem Cells,2005;23(4):530-43.

12 Huang JS,Chuang LY,Guh JY,et al.Effect of nitric oxide-c GMP-dependent protein kinase activation on advanced glycation end-product-induced proliferation in renal fibroblasts〔J〕.J Am Soc Nephrol,2005;16(8):2318-29.

13 Wesoly J,Szweykowska-Kulinska Z,Bluyssen HA.STAT activation and differential complex formation dictate selectivity of interferon responses〔J〕.Acta Biochim Pol,2007;54(1):27-38.

14 Berishaj M,Gao SP,Ahmed S,et al.Stat3 is tyrosine-phosphorylated through the interleukin-6/glycoprotein 130/Janus kinase pathway in breast cancer〔J〕.Breast Cancer Res,2007;9(3):32-8.

15 Hao XR,Cao DL,Hu YW,et al.IFN-gamma down-regulates ABCA1 expression by inhibiting LXRalpha in a JAK/STAT signaling pathway-dependent manner〔J〕.Atherosclerosis,2009;203(2):417-28.

16 Levy O,Granot Y.Arginine-vasopressin activates the JAK-STAT pathway in vascular smooth muscle cells〔J〕.JBiol Chem,2006;281(23):15597-604.

17 Ciechanover A.The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway〔J〕.Cell,1994;79(1):13-21.

18 Musti AM,Treier M,Peverali FA,et al.Differential regulation of c-Jun and JunD by ubiquitin-dependent protein degradation〔J〕.Biol Chem,1996;377(10):619-24.

19 Herrmann J,Soares SM,Lerman LO,et al.Potential role of the ubiquitin-proteasome system in atherosclerosis:aspects of a protein quality diseas〔J〕.J Am Coll Cardiol,2008;51(21):2003-10.

20 Marfella R,Siniscalchi M,Portoghese M,et al.Morning blood pressure surge asa destabilizing factor of atherosclerotic plaque:role of ubiquitinproteasome activity〔J〕.Hypertension,2007;49(4):784-91.

21 Marfella R,Di Filippo C,Laieta MT,et al.Effects of ubiquitin-proteasome system deregulation on the vascular senescence and atherosclerosis processin elderly patients〔J〕.J Gerontol A Biol SciMed Sci,2008;63(2):200-3.

22 Yamada T,Satoh S,Sueyoshi S,et al.Ubiquitin-positivefoam cells are identified in the aortic and mitral valves with atherosclerotic involvement〔J〕.J Atheroscler Thromb,2009;16(4):472-9.

23 Polakis P.The many ways of Wnt in cancer〔J〕.Curr Opin Genet Dev,2007;17(1):45-51.

24 Lee DK,Nathan Grantham R,Trachte AL,et al.Activation of thecanonical Wnt/beta-catenin pathway enhances monocyte adhesion to endothelial cells〔J〕.Biochem Biophys Res Commun,2006;347(1):109-16.

25 Bauman JE,Eaton KD,Martins RG.Antagonism of platelet derived growth factor receptor in nonsmall cell lung cancer:rationale and investigations〔J〕.Clin Cancer Res,2007;13(15):4632-36.

26 Kirton JP,Crofts NJ,George SJ,et al.Wnt/beta-catenin signaling stimulates chondrogenic and inhibits adipogenic differentiation of pericytes:potential relevance to vascular disease〔J〕?Circ Res,2007;101(6):581-9.

27 Christman MA 2nd,Goetz DJ,Dickerson E,et al.Wnt5a is expressed in murine and human atherosclerotic lesions〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol,2008;294(6):2864-70.

28 Funakoshi Y,Ichiki T,Shimokawa H,et al.Rho-kinase mediates angiotensin II-induced monocyte chemoattractant protein-1 expression in rat vascular smooth muscle cells〔J〕.Hypertension,2001;38(1):100-4.

29 Takeda K,Ichiki T,Tokunou T,et al.Critical role of Rho-kinase and MEK/ERK pathways for angiotensin II-induced plasminogen activator inhibitor type-1 gene expression〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Boil,2001;21(5):868-73.

30 van Nieuw Amerongen GP,Vermeer MA,van Hinsbergh VW.Role of RhoA and Rho kinase in lysophosphatidic acid-induced endothelial barrier dysfunction〔J〕.Arerionscler Thromb Vasc Boil,2000;20(12):127-33.

31 Alexander JS.Rho,tyrosine kinase,Ca(2+),and junctions in endothelial hyperpermeability〔J〕.Circ Res,2000;87(4):268-71.

32 Sauzeau V,Le Mellionnec E,Bertoglio J,et al.Human urotensin II-induced contraction and arterial smooth muscle cell proliferation aremediated by RhoA and Rho-kinase〔J〕.Circ Res,2001;88(11):1102-4.

33 Mori-Kawabe M,Tsushima H,Fujimoto S,et al.Role of Rho/Rho-kinase and NO/cGMPsignaling pathways in vascular function prior to atherosclerosis〔J〕.JAtheroscler Thromb,2009;16(6):722-32.

34 Zhou Q,Liao JK.Rho kinase:an important mediator of atherosclerosis and vascular disease〔J〕.Curr Pharm Des,2009;15(27):3108-15.