G-CSF干預對老齡慢性腦缺血大鼠模型認知改善與膠質細胞可塑性的影響

舒細記 柳 威 周紅艷 陳 瑩 陳艷華 熊巍鵬 艾永循

(江漢大學醫學院病理學與病理生理學教研室,湖北 武漢 430056)

慢性腦血管疾病是人類非自然死亡和致殘的主要原因之一,慢性腦缺血是多種老年慢性腦血管疾病的共同病理過程,可致中樞神經細胞缺失與功能障礙〔1,2〕。粒細胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor,G-CSF)作為骨髓干細胞的動員劑,可動員外周血骨髓干細胞向中樞神經系統遷移,分化成神經細胞和膠質細胞,促進中樞神經系統損傷的修復。目前已有 G-CSF干預急性腦缺血〔3,4〕或局灶性腦缺血〔5,6〕損傷后神經細胞再生的相關研究,但針對慢性腦缺血損傷后膠質細胞可塑性的研究未見報道。本研究通過構建慢性腦缺血老齡鼠模型,從認知功能改善和星形膠質細胞可塑性改變的角度,探討G-CSF對老齡鼠海馬慢性腦缺血損傷的神經修復作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性 SD大鼠 35只,鼠齡 12個月,體重(360±45)g,由華中科技大學同濟醫學院實驗動物學部提供。構模后符合實驗設計要求的15個月老齡鼠有 27只。

1.2 藥物及試劑 重組人粒細胞集落刺激因子(商品名瑞白)齊魯制藥有限公司產品;膠質纖維酸性蛋白(GFAP)單克隆抗體,Maxim Biotech公司產品;二步法免疫組織化學檢測試劑盒,PV-9000,GBI公司產品。

1.3 慢性腦缺血模型的建立與實驗分組 采用 1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(35～40 mg/kg),分離并永久結扎雙側頸總動脈(two-vessel occlusion,2VO),構建 2VO模型。假手術組(Sham)方法同上,僅分離但不結扎 2VO作為對照。將行 2VO術及 Sham組大鼠術后飼養 3個月。符合實驗設計要求(2VO、術后存活 3個月以上,即鼠齡 15個月以上)的 2VO模型鼠 17只,分為 2VO/G-CSF組 (10只)、2VO/生理鹽水(NS)組 (7只)。Sham組大鼠存活 10只。G-CSF干預劑量為 10μg/kg,NS的安慰劑量約為 0.1 ml/只(對照組 NS的劑量盡量與治療組使用 G-CSF的容積一致),均皮下注射,連續 3d,停藥 5d,完成水迷宮實驗后立即處死大鼠,取材制作組織切片。

1.4 學習記憶能力評估 水迷宮實驗采用成都泰盟MT-200 Morris水迷宮視頻跟蹤系統。其中,定位航行實驗評估其空間學習能力,空間探索實驗評估其空間記憶能力。適應性訓練:正式實驗前1 d大鼠在無逃逸平臺的水池中適應性游泳2 min。定位航行實驗:連續 5 d,每日上午將大鼠面向池壁從不同象限入水,找到平臺后站立 15 s,記錄其找到隱匿平臺所耗的逃逸時間,再從平臺上移開休息 60 s后進行下一輪實驗。如果大鼠在 120 s內未找到平臺,在操作者的引導下上平臺,逃逸時間記為 120 s。空間探索實驗:完成定位航行實驗后撤去平臺,將大鼠從平臺所在的對面象限中放入水池,記錄 2 min內大鼠穿過平臺所在區域的次數及停留于平臺所在象限的時間。

1.5 組織病理學檢查與圖像分析 4%多聚甲醛全身灌注固定,海馬取材定位于前囟后 3.7 mm處,取含海馬組織制片,蘇木素-伊紅(HE)染色。免疫組化染色。采用即用型 GFAP抗體及 PV-9000試劑盒完成,設 PBS為陰性對照,已知陽性切片為陽性對照,GFAP以細胞質出現棕色顆粒為陽性。免疫熒光染色取同部位的相鄰切片,采用 Hoechst 33258染色液室溫下染色,凋亡細胞以細胞核呈致密藍染顆粒為準。采用MOTIC公司 Med 6.0系統進行圖像分析。全部樣本在 40倍視野選取目標區域 CA 1區,再在高倍鏡下(400倍)隨機選定起始區后連續采集 5個高倍視野,每個視野選取 10個胞質突起完整的 GFAP陽性細胞,用標準網格記錄GFAP陽性細胞數,同時,每個待測細胞取最長的一個胞質突起,記錄其測量長度(μm)。

1.6 統計學分析 采用 SPSS13.0及 Excel2003軟件,數值以±s表示。定位航行實驗數據采用重復測量數據方差分析的最小顯著差(LSD)法進行組間比較,其他數據采用單因素方差分析,空間記憶功能與星形膠質細胞可塑性的相關性分析采用Pearson法。

2 結 果

2.1 常規病理組織學觀察 相對于 Sham組,2VO/NS組老齡鼠海馬 CA 1區錐體細胞排列稀疏而紊亂,GFAP陽性細胞胞質突起分支少而短小,部分胞質突起崩解消失,毛細血管壁附近有較多的 GFAP陽性細胞突起。相對于 2VO/NS組,2VO/GCSF組錐體細胞胞體增大,胞漿豐富,細胞排列層數增多,而GFAP陽性細胞的胞質突起明顯纖長,分支增多。

2.2 GFAP陽性細胞數量的變化 海馬 CA 1區 GFAP陽性細胞 2VO/NS組(25.53±7.17)顯著少于 Sham組(63.79±11.57),兩者的差異有統計學意義(F=7.93,P＜0.05);顯示2VO老齡鼠模型中存在慢性腦缺血損傷。海馬CA1區 GFAP陽性細胞 2VO/G-CSF組(36.47±6.21)明顯多于 2VO/NS組,兩者的差異有統計學意義(F=6.21,P＜0.05)。

2.3 GFAP陽性細胞胞質突起的變化 2VO/NS組海馬 CA1區 GFAP陽性細胞的胞質突起明顯縮短、分支減少,平均長度(157.43±19.27)μm,明 顯 短 于 Sham組 〔(243.31±53.34)μm〕,差異有統計學意義(F=9.68,P＜0.05)。2VO/GCSF組 GFAP陽性細胞的胞質突起分支多而纖長,平均長度(189.11±37.01)μm,明顯長于 2VO/NS組,差異有統計學意義(F=7.82,P＜0.05)。

2.4 G-CSF對老齡缺血大鼠認知功能的干預作用 定位航行實驗發現,隨著訓練次數的增加,各組大鼠找到隱匿平臺的逃逸時間呈逐漸縮短的趨勢。2VO/NS組的逃逸時間高于 Sham組(F=72.58,P＜0.01)。2VO/G-CSF組逃逸時間顯著低于2VO/NS組(F=153.40,P＜0.01)。空間探索實驗發現,2VO/NS組大鼠停留于平臺所在象限的時間(8.90±4.51)s低于Sham組(15.63±4.35)s(P＜0.05);2VO/NS組大鼠跨越平臺所在區域的次數(3.55±1.07)少于 Sham組(8.77±3.64)(P＜0.01)。2VO/G-CSF組大鼠停留于平臺所在象限的時間(15.35±4.21)s高于 2VO/NS組(P＜0.01);2VO/G-CSF組大鼠跨越平臺次數(8.52±2.68)明顯多于 2VO/NS組(P＜0.01)。見表 1。

表1 各組大鼠定位航行的逃逸時間(±s,s)

與 Sham組比較:1)P＜0.01;與 2VO/NS組比較:2)P＜0.05,3)P＜0.01

組別 n 第1天 第 2天 第3天 第 4天 第5天Sham組 10 66.12±7.33 45.08±6.91 31.07±5.26 22.15±3.53 16.03±2.29 2VO/NS組 7 94.98±14.751) 78.52±13.111) 64.95±11.381) 43.05±4.371) 29.17±1.631)2VO/G-CSF組 10 81.53±8.092) 54.24±9.033) 43.93±7.083) 29.03±4.813) 19.55±2.463)

2.5 老齡缺血大鼠認知功能改善與膠質細胞可塑性的相關性分析 2VO/NS組、2VO/G-CSF組、Sham組的空間記憶改善趨勢與對應的膠質細胞可塑性變化的相關性分析顯示:各組海馬CA1區 GFAP陽性細胞胞質突起的長度變化與各組對應停留時間的變化趨勢(R=0.697,F=0.645,P＜0.05)、穿過平臺區域次數的變化趨勢(R=0.624,F=0.619,P＜0.05)均呈正相關;各組老齡缺血大鼠海馬 CA 1區 GFAP陽性細胞的數量變化與對應的停留于平臺所在象限的時間變化趨勢(R=0.711,F=7.593,P＜0.05)、穿過平臺區域的次數變化趨勢(R=0.731,F=8.754,P＜0.05)呈正相關。提示海馬膠質細胞可塑性與空間記憶能力改善密切相關。

3 討 論

2VO是慢性腦缺血的理想模型,2VO可致大腦持續性低血流灌注,但腦組織未見明顯的壞死區,也未見明顯的運動功能障礙,如肢體癱瘓等中樞運動神經系統損傷癥狀,與人類慢性腦缺血的病理過程相似〔7〕。慢性腦缺血類疾病多好發于老年人,本研究對 12月齡大鼠開始 2VO手術,持續低血流灌注 3個月,實際觀察分析時已是 15月齡的 2VO老齡鼠。以往研究構建的腦缺血模型較少考慮年齡對缺血損傷的影響,本實驗模型與臨床癥狀較為吻合。G-CSF對于造血細胞的生長和分化起重要介導作用,具有刺激骨髓干細胞增殖、分化、成熟以及介導細胞毒作用、趨化作用等生物學功能。海馬與學習記憶密切相關,是腦缺血損傷最敏感的區域之一,其損傷可以導致學習記憶等認知功能障礙。

本研究在行為學層面,通過定位航行實驗發現,G-CSF干預后慢性腦缺血大鼠的逃逸時間顯著縮短,空間學習能力明顯改善。空間探索實驗發現,G-CSF干預后慢性腦缺血大鼠停留于平臺所在象限的時間及跨越平臺次數均顯著增多,空間記憶能力明顯改善。提示G-CSF可有效改善慢性腦缺血所致的認知功能障礙。在病理組織學層面,就海馬錐體細胞增生而言,本研究發現 G-CSF干預后海馬CA 1區錐體細胞胞體增大,胞漿豐富,細胞排列層數明顯增多。就海馬膠質細胞可塑性而言,星形膠質細胞(GFAP為其特異性分子標記物)為海馬區最主要的膠質細胞,星形膠質細胞具有通過改變自身特性適應損傷刺激的能力,即可塑性,其表型上的可變性包括:細胞數量上的增加,細胞胞體、胞核大小及突起長度的變化,其中以胞質突起長度變化最為明顯〔8,9〕。本研究中 Sham組 GFAP陽性細胞數量最多、胞質突起長度最長,2VO/G-CSF組次之,2VO/NS組最次(部分GFAP陽性細胞胞質突起甚至崩解)。Sham組與 2VO/NS組、2VO/G-CSF組與 2VO/NS組的 GFAP陽性細胞數量及胞質突起長度的組間分析,前者提示慢性腦缺血對海馬區星形膠質細胞的損傷作用,后者提示G-CSF可有效促進海馬區星形膠質細胞的可塑性變化。本研究對 G-CSF干預后空間記憶改善與膠質細胞可塑性進行相關性分析,發現大鼠停留于平臺所在象限的時間、穿過平臺區域的次數與海馬 GFAP陽性細胞的數量及其胞質突起長度均呈正相關,進一步提示,G-CSF干預后的星形膠質細胞可塑性變化與認知改善密切相關。

認知障礙改善主要在于海馬神經細胞和膠質細胞的修復。本研究中 G-CSF干預后星形膠質細胞數量增加,胞體增大,胞質突起長度增加、分支增多。新生星形膠質細胞的可塑性改變,一方面可為神經細胞遷移提供腳手架,促進神經細胞間突觸網路的建立,還可釋放出興奮性氨基酸、前列腺素等神經活性物質調控神經細胞的功能〔10,11〕。另一方面,也可促進星形膠質細胞間的信息交流傳遞,并與神經元相互作用,影響神經元的生物活性,在神經信息傳遞、整合和調控過程中起關鍵作用〔12,13〕。由此推斷,G-CSF干預后星形膠質細胞的可塑性變化與錐體細胞增生一樣,也是認知功能改善的重要病理修復機制。此外,有學者〔14〕提出在腦缺血干預的時機上存在“多個治療機會窗”的概念,包括腦缺血前初級預防機會窗、次級預防機會窗、腦缺血超早期干預機會窗以及腦缺血損傷后的恢復期和修復期可能存在的“治療機會窗”。本研究是在大鼠持續性缺血 3個月后給予 G-CSF干預的,結果表明,在錯失前期預防、早期干預的情況下,在持續腦缺血時間較長的損傷后期也是重要的補救治療機會窗。

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