神經干細胞相關研究進展

方 慶 陳新生

（安徽醫科大學附屬安慶醫院神經外科，安徽 安慶 246003）

神經干細胞相關研究進展

方 慶 陳新生

（安徽醫科大學附屬安慶醫院神經外科，安徽 安慶 246003）

神經干細胞

1992年Reynolds等首次報道了從成鼠腦紋狀體中分離出能夠在體外增值并且具有向神經元及膠質細胞分化潛能的神經干細胞。近年來，神經干細胞的研究及應用對目前迅速發展的生命科學產生了巨大的影響，神經干細胞能夠促進神經元細胞的再生及腦組織的修復，并且可以應用于神經系統的基因治療，表達神經營養因子、代謝酶及神經遞質，為神經系統疾病的治療提供了新的有效途徑。本文就神經干細胞的最新研究進展和應用作一綜述。

1 神經干細胞的概念

神經干細胞（NSC）是干細胞的一種，是存在于腦和脊髓中的未分化細胞，同其他干細胞一樣，神經干細胞也具有分裂增殖和多樣分化的特點，具有自我更新能力，它能夠分化為神經元、星形膠質細胞、少突膠質細胞等多種類型的神經組織細胞，它屬于專能干細胞。1989年Anderson等首次提出了神經干細胞的概念，隨后Reynolds和Cattaneo等分別報道了NSC的發現及NSC的特性。2000年Gage[1]將神經干細胞概括為可生成神經組織或者來源于神經系統的具有自我更新能力并且能夠通過不對稱細胞分裂產生的新細胞。

2 神經干細胞的來源及分布

2.1 胚胎神經干細胞

中樞神經系統神經干細胞來源于囊胚期內細胞群，至少分為神經球干細胞和神經上皮干細胞兩類，前者依賴于表皮生長因子（EGF）發育分化，后者依賴于成纖維生長因子（FGF）發育分化[2]。1981年Evans等首次在實驗中從小鼠囊胚中得到了第1個哺乳動物來源的胚胎神經干細胞。Thomson等[3]在1998年從體外受精的多余囊胚中建立了人胚胎神經干細胞系。哺乳動物的胚胎腦中神經干細胞主要分布于以下7個部位：腦室下帶、海馬、嗅球、脊髓、小腦、側腦室腦（室管膜上皮）和大腦皮質。研究認為不同部位的神經干細胞可能分別屬于不同的干細胞群體，并非同一類干細胞分布在不同的位置，所以腦的正常發育不僅取決胚胎神經干細胞增值與分化，而且還取決于胚胎神經干細胞哪些細胞會發生程序性死亡或者凋亡[4]。

2.2 成體神經干細胞

成體神經干細胞專指分布于胚胎、成人中樞神經系統及周圍神經系統中干細胞。主要存在于腦室區、腦室下區、海馬、紋狀體、嗅球、脊髓等部位，在所有的成體哺乳動物腦內有兩個高密度的細胞分化區，即腦室下區和海馬齒狀回的粒下區。由于成體神經干細胞可以來源患者本人，通過體外擴增后再移植回患者本人的腦組織，所以可以避免免疫排斥，有可能解決限制神經干細胞應用的免疫排斥及倫理道德方面的難題[5]。但是由于從成人神經系統提取成體神經干細胞手術風險高，此類細胞也存在于胎兒的腦中[6]，所以實驗和臨床應用中均是在利用流產胎兒的胎腦中提取成體神經干細胞。田增民等[7,8]在研究中將取自于胎兒胎腦的成體神經干細胞移植入小腦萎縮及帕金森癥的患者腦中取得良好的效果，患者神經系統功能障礙得到明顯改善。

2.3 間充質神經干細胞

由于間充質細胞具有分化成為間質起源的任意組織的潛能[9-12]，這使得間充質干細胞成為神經干細胞研究的一個新的熱點。由于間充質干細胞取材范圍廣，并且可以取自自體組織，所以解決了免疫排斥和倫理道德的問題，成為組織工程中的神經干細胞的最佳選擇。間充質干細胞分布廣泛，不僅存在于骨髓中，還可以從外周血、肌肉組織、牙齒組織、大腦及臍帶血、胎兒器官中分離得到[13,14]，并且有報道從臍帶靜脈內皮下及羊水中也能分離得到間充質干細胞分化為神經干細胞[15,16]。Jeong等[17]發現將從臍帶血中分離得到的間充質干細胞在特定培養基中培養后，能夠迅速分化成為神經元細胞及神經膠質細胞。很多實驗已經證實由間充質神經干細胞移植后能夠明顯改善神經系統的功能[18]。Bliss等認為間充質神經干細胞移植后改善神經系統功能的機制可能是分泌出神經營養因子增強神經系統的修復機制而不是替代損傷的神經組織[19]。

3 神經干細胞的生物學特性

神經干細胞具有強大的增值分裂能力，它的主要生物學特性包括：①自我更新能力：神經干細胞具有自我更新和高度增值的能力，一定的條件下能夠進行有絲分裂。有絲分裂分為兩類即對稱分裂和不對稱分裂。②多分化潛能：神經干細胞能夠分化成為神經元細胞、少突膠質細胞及星形膠質細胞。③遷徙能力：在神經系統的發育過程中，神經干細胞不斷的進行遷徙，并且受到病變部位神經源性信號的影響，參與神經結構和功能的修復。④良好的組織相容性：研究中發現移植的神經干細胞能夠通過血腦屏障，在腦組織中與宿主細胞在結構功能上形成良好的整合。⑤可以被轉染并穩定的表達外源性基因。⑥可以分離出單個細胞克隆。

4 神經干細胞的培養與鑒定

4.1 神經干細胞的培養

目前多數神經干細胞的培養采用無血清細胞培養和細胞克隆技術進行分離。在培養液中添加胰島素、黃體酮、腐胺、谷酰胺、轉鐵蛋白及具有絲裂原作用的生長因子。神經干細胞目前最基本的兩種培養方式是懸浮培養和單層貼壁培養，Reynold等大部分學者主要采用懸浮培養的方式來培養神經干細胞。以此種方式培養的神經干細胞在培養基中以神經球的方式生長，有研究表明在瓊脂糖抗貼壁培養瓶中以懸浮培養的方式培養神經干細胞有利于神經干細胞的持續增殖，提示瓊脂糖抗貼壁培養適合神經干細胞的大量擴增[20]。但是此種方法培養神經干細胞的時候，隨著神經球的增長，營養物質和氧氣滲入減少并且代謝廢物排除受阻，內部較易出現凋亡、壞死，甚至出現神經球中空的情況。Gage等[21]在研究中曾采用單層貼壁的方式培養神經干細胞，此種方法不存在營養物質交換困難的問題，但是細胞只能向二維生長，不能提供組織正常生長發育所需要的環境條件，然而環境條件對細胞的基因表達和生物學行為起著相當重要的作用，所以單層細胞培養所反映的生物學特性，與體內組織細胞相差較大。近年來，很多研究者采用具有三維結構的支架材料來進行神經干細胞的培養取得了良好的效果[22]，支架材料為細胞提供結構支撐，提供與體內組織更加相似的細胞生長微環境，利于組織的生成[23]。

4.2 神經干細胞的鑒定

目前，對于神經干細胞的鑒定主要有形態觀察和標志物檢測，但是最準確的方法還是標志物的檢測。光鏡下神經干細胞的形態學有如下特點：①未分化的干細胞主要以兩種形式存在：一種是散在生長分布的神經干細胞，細胞大而圓且呈良好的活力狀態。另一種是形成神經球的神經干細胞，呈島嶼狀存活，邊緣清楚，表面光滑，結構致密，隆起生長，組成細胞球的細胞圓潤飽滿呈較佳活力狀態。②不同部位來源的神經干細胞的生長特性不同。③神經干細胞的核型分析。目前神經干細胞的標志物檢測最常用的是神經元中間絲蛋白，包括巢蛋白（nestin）和神經元RNA結合蛋白Musashil。其次，角質細胞標志物（GFAP）、vimentin、CD133等也有應用，另外神經元NeuN、抗神經元特異性標記物β-tubulin-Ⅲ、5-溴-2-脫氧尿苷（BrdU）等也常用于神經干細胞的熒光鑒定。

5 神經干細胞分化的影響因素

研究表明，神經干細胞的分化由外源性因素（細胞因子）和內源性因素（基因）共同調控，其中內源性因素起著決定作用。

5.1 外源性因素

神經干細胞分化的外源性因素主要包括：①生長因子（如FGF2、EGF、BDNF、NT3、LIF等[24]），目前研究認為堿性成纖維細胞生長因子（FGF2）和表皮生長因子（EGF）等在神經干細胞的分化中起著最重要的作用，其他生長因子主要起到協同作用；②微環境：包括神經干細胞附近的神經細胞、膠質細胞和細胞外基質成分等。有研究發現星形膠質細胞與神經干細胞共同培養時，神經干細胞分化速度明顯加快，提示星形膠質細胞可誘導神經干細胞向神經元細胞分化[25]。另外有實驗發現許多神經遞質如甘氨酸、腎上腺素、GABA、乙酰膽堿等也參與神經干細胞的分化的調節。

5.2 內源性因素

研究表明，神經干細胞分化的多樣性可能與轉錄因子有關。不同的轉錄因子促進神經干細胞向不同的譜系分化。神經干細胞的基因調控包括正性調節和負性調節。正性調節是通過不對稱分裂使神經干細胞分化，其中bHLH轉錄因子包括NeuroD、Mash1和Math家族等[26]，bHLH基因主要調節神經元及神經膠質細胞的選擇，如錯誤表達，可使分化的神經元細胞減少，但是對神經膠質細胞的分化無影響[27]。負性調節則是通過對稱性分裂增加神經干細胞的數量，但是使神經干細胞不分化，主要包括Notch信號等途徑，與bHLH的作用相反，Notch的作用主要是抑制神經干細胞向神經元方向分化，促進神經干細胞向膠質細胞方向分化。

6 神經干細胞的應用研究

神經干細胞的應用目前已經在神經系統損傷、神經系統腫瘤、壞死性疾病等方面開展了治療研究。目前神經干細細的研究主要通過以下途徑：①將神經干細胞體外擴增移植到病損部位；②將生長因子導入神經干細胞，組織神經細胞的變性壞死；③誘導內源性神經干細胞的激活、增殖來促進損傷神經的修復。Hideyuk等[28]在研究中將小鼠胚胎神經干細胞移植入成鼠脊髓挫傷區后，小鼠的運動功能有所改善。田增民等[8]應用人胚胎神經干細胞植入帕金森患者的紋狀體，取得良好效果。

7 問題與展望

神經干細胞的發現為中樞神經性的重建和神經的再生提供了一個新的思路，打破了傳統觀念所認為的中樞神經系統損傷后不能再生，只能由星形膠質細胞增生，瘢痕組織代替缺失的神經元。但是目前神經干細胞的研究中還有很多問題亟待解決，如定向誘導分化是目前神經干細胞應用于臨床的一個關鍵問題，我們還很難得到來源于同一譜系，分化程度一致，細胞無異質性的神經干細胞[29]；神經干細胞移植后顯效慢，移植后患者腦內瘤樣團塊的形成，倫理上的爭議都是目前制約神經干細胞臨床應用的問題。

[1] Gage HF.Mammalian neural stem cells[J].Science,2000,287(5457): 1433-1438.

[2] Garcia-Verdugo JM,Ferron S,Flames N,et al.The proliferative ventricular zone in adult vertebrates:a comparative study using reptiles,birds,and mammals[J].Brain Res Bull,2002,57(6):765-775.

[3] Thomson JA,Itskovitz-Eldor J,Shapiro SS,et al.Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts[J].Science,1998,282 (5391):1145-1147.

[4] Zhang Q,Qin H,Lang B,et al.Different regions of the mouse nestin enhancer may function differentially in nestin expression in an NSC-like cell line and astrocytes[J].Neurosci Lett,2005,379(2):90-95.

[5] Peterson DA.Stem cells in brain plasticity and repair[J].Curr Opin Pharmacol,2002,2(1):34-42.

[6] Terskikh AV,Bryant PJ,Schwartz PH.Mammalian stem cells[J]. Pediatr Res,2006,59(4 Pt 2):13-20.

[7] 田增民,李志超,尹豐等.人神經干細胞移植治療小腦萎縮[J].第二軍醫大學學報,2004,25(9):933-935.

[8] 田增民,劉爽,李士月等.人神經干細胞臨床移植治療帕金森[J].第二軍醫大學學報,2003,24(9):957-959.

[9] Snyder EY,Daley GQ,Goodell M.Taking stock and planning for the next decade:realistic prospects for stem cell therapies for the nervous system[J].J Neurosci Res,2004,76(2):157-168.

[10] Bliss T,Guzman R,Daadi M,et al.Cell transplantation therapy for stroke[J].Stroke,2007,38(2 Suppl):817-826.

[11] Boyle AJ,Schulman SP,Hare JM,et al.Is stem cell therapy ready for patients?Stem Cell Therapy for Cardiac Repair.Ready for the Next Step[J].Circulation,2006,114(4):339-352.

[12] Vddndnen HK.Mesenchymal stem cells[J].Ann Med,2005,37(7): 469-479.

[13] Wislet-Gendebien S,Hans G,Leprince P,et al.Plasticity of cultured mesenchymal stem cells:switch from nestin-positive to excitable neuron-like phenotype[J].Stem Cells,2005,23(3):392-402.

[14] 尹國才,陳新生,鄭愛芳等.人胎腦神經干細胞在發育期腦脊液中的遷移和分化[J].中國組織工程研究與臨床康復,2010,14(1): 24-27.

[15] Romanov YA,Svintsitskaya VA,Smirnov VN.Searching for alternative sources of postnatal human mesenchymal stem cells:candidate MSC-like cells from umbilical cord[J].Stem Cells,2003,21(1):105-110.

[16] 馮建勛,臘曉林,馬 艷等.SD大鼠羊水間充質干細胞向神經樣細胞體外誘導分化[J].世界華人消化雜志,2010,18(3):250-255.

[17] Jeong JA,Gang EJ,Hong SH,et al.Rapid neural differentiation ofhuman cord blood-derived mesenchymal stem cells[J].Neuroreport, 2004,15(11):1731-1734.

[18] Satake K,Lou J,Lenke LG.Migration of mesenchymal stem cells through cerebrospinal fluid into injured spinal cord tissue[J].Spine, 2004,29(18):1971-1979.

[19] Bliss T,Guzman R,Daadi M,et al.Cell transplantation therapy for stroke[J].Stroke,2007,38(2 Suppl):817-826.

[20] 鄭學勝,劉偉國,楊小鋒.一種新的神經干細胞抗貼壁培養方法[J].解剖學報,2006,37(2): 236-239.

[21] Gage FH.Stem cells of the central nervous system[J].Curr Opin Neurobiol,1998,8(5):671-676.

[22] Irons HR,Cullen DK,Shapiro NP,et al.Three-dimensional neural constructs:a novel platform for neurophysiological investigation [J].J Neural Eng,2008,5(3):333-341.

[23] Nakajima M,Ishimuro T,Kato K,et al.Combinatorial protein display for the cell-based screening of biomaterials that direct neural stem cell differenitiation[J].Biomaterials,2007,28(6): 1048-1060.

[24] 尹國才,欒佐,閆鳳青等.LIF對人胎腦神經干細胞在體外增殖和分化的影響[J].中國免疫學雜志,2005,21(6):449-454.

[25] Zhou YF,Fang F,Fu JR.An experimental study on astrocytes promoting production ofneural stem cells derived from mouse embryonic stem cells[J].ChinMed J (Engl),2005,118(23): 1994-1999.

[26] Seo S,Richardson GA,Krollk I.The SWI/SNF chromatin remodeling protein Brg1 is required for vertebrate neurogenesis and mediates transactivation of Ngn and NeuroD[J].Development, 2005,132(1):105-115.

[27] Allan DW,Park D,St Pierre SE,et al.Regulators acting in combinatorial codes also act independently in single differentiating neurons[J].Neuron,2005,45(5):689-700.

[28] Hideyukio.Neural stem cells as therapeutic agents for CNS injuries and disorders[J].Int Congress Series,2003,1252:493-498.

[29] 王忠誠.神經干細胞在中樞神經系統損傷修復中的應用前景[J].中國康復理論與實踐,2004,10(1):1.

R329.2

A

1671-8194（2011）08-0044-03