肺癌干細(xì)胞Wnt信號(hào)通路的研究進(jìn)展

李小江 賈英杰 張文治 張瑩 李寶樂 黃敏娜 包芳芳 吳建國(guó) 婁怡

肺癌是全球發(fā)病率最高的惡性腫瘤，己成為人類因癌癥死亡的主要原因[1]。近年來隨著干細(xì)胞概念被引入腫瘤學(xué)的研究，以及多種腫瘤組織和癌細(xì)胞系中腫瘤干細(xì)胞得到成功分離和鑒定，“腫瘤干細(xì)胞”學(xué)說應(yīng)運(yùn)而生[2]。2007年肺癌干細(xì)胞的研究獲得突破性進(jìn)展，Ho等[3]首次發(fā)現(xiàn)利用Hoechst染料外排法從多種人肺癌細(xì)胞系和人肺癌臨床樣本中分離出的SP細(xì)胞表現(xiàn)出體外高致瘤率、細(xì)胞表面的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白表達(dá)上調(diào)、人端粒末端轉(zhuǎn)移酶表達(dá)增高等與干細(xì)胞相似的特性，說明這部分SP細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞特性。Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路作為細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)之一，與肺癌的發(fā)生發(fā)展以及在肺癌干細(xì)胞特性維持過程中有著重要作用[4]。Wnt信號(hào)通路的不恰當(dāng)激活，參與了腫瘤的發(fā)生及其侵襲轉(zhuǎn)移的過程，該通路可能通過作用于肺癌干細(xì)胞而促使肺癌細(xì)胞復(fù)制更新或轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)。肺癌干細(xì)胞Wnt通路的研究為肺癌治療提供了新的突破口。

1 Wnt信號(hào)通路

Wnt信號(hào)通路因其啟動(dòng)蛋白質(zhì)Wnt而得名。Wnt最初被發(fā)現(xiàn)為果蠅分節(jié)極性基因，其功能與胚胎發(fā)育和蛻變過程中成體翼的形成有關(guān)，Nusse等于1982年在小鼠乳頭瘤病毒整合部位發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了int-1基因，隨后發(fā)現(xiàn)這一基因與果蠅胚胎發(fā)育基因wingless同源，將兩者名稱簡(jiǎn)并后該基因被重新命名為Wnt。越來越多的證據(jù)[5-7]表明Wnt信號(hào)途徑異常激活參與了多種人類腫瘤的發(fā)生，此信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在維持腫瘤干細(xì)胞的特性如腫瘤干細(xì)胞的數(shù)量、耐藥性、克隆形成能力、體內(nèi)成瘤性等方面也有著重要作用。

2 Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑

2.1 Wnt經(jīng)典信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑 即Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[8]。目前國(guó)外已在包括肺癌等多種實(shí)體瘤中檢測(cè)到β-catenin的高表達(dá)[9]。

在沒有Wnt信號(hào)刺激的情況下，β-catenin與axin/APC、GSK-3β組成的降解復(fù)合物結(jié)合，通過磷酸化、蛋白質(zhì)泛素化等過程發(fā)生降解，使胞質(zhì)β-catenin保持在較低水平[10]。TCF/LEF與抑制物結(jié)合，阻礙下游基因的表達(dá)。Wnt信號(hào)通路啟動(dòng)后，Wnt配體與細(xì)胞膜表面的Fz/LRP受體結(jié)合，β-catenin即從axin/APC、GSK-3β組成的降解復(fù)合物分離，在細(xì)胞內(nèi)積聚并向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，與TCF/LEF結(jié)合[11]，從而調(diào)節(jié)下游靶基因c-myc、 Cyclin D1的表達(dá)。作為決定細(xì)胞從G0/G1期進(jìn)入S期的開關(guān)，c-myc基因不顯示轉(zhuǎn)錄活性或呈低水平表達(dá)；只有受某些因子激活時(shí)，c-myc基因才大量表達(dá)[12,13]，使細(xì)胞由靜止期進(jìn)入增殖期，促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、侵潤(rùn)與轉(zhuǎn)移。Cyclin D1是作用于G1期的重要的細(xì)胞周期蛋白，可以促進(jìn)G1/S期轉(zhuǎn)換而加速細(xì)胞周期過程。Cyclin D1經(jīng)選擇性剪切后可得到一種編碼特殊的異構(gòu)體cyclin D1b。細(xì)胞增殖與細(xì)胞凋亡相互協(xié)調(diào)，共同維持細(xì)胞數(shù)量的相對(duì)穩(wěn)定，不至于細(xì)胞數(shù)量過度增減[14]。所以，c-myc是較早出現(xiàn)的Cyclin D1的異常表達(dá)，是細(xì)胞惡化的分子標(biāo)志，與肺癌啟動(dòng)、惡性增生密切相關(guān)[15]。

2.2 Wnt-Ca2+途徑[16]Ca2+途徑的主要過程為Wnt蛋白質(zhì)結(jié)合于Fz受體，由Wnt-5a或Wnt-11激活卷曲蛋白質(zhì)受體后，通過三聚體G蛋白質(zhì)介導(dǎo)，使細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，從而對(duì)鈣調(diào)蛋白質(zhì)依賴的激酶（CaMKII）、蛋白質(zhì)激酶C（PKC）起作用，活化T細(xì)胞核因子，核內(nèi)NFAT的積聚導(dǎo)致靶基因的激活。Ca2+途徑多由Wnt-5a等低轉(zhuǎn)化型Wnt蛋白質(zhì)激活，也參與原腸胚的形成，并且對(duì)于β-catenin途徑起抑制作用[17]。

2.3 Wnt-細(xì)胞平面極化途徑[16]即PCP信號(hào)途徑，Wnt蛋白質(zhì)直接作用于Fz受體，使Dvl活化進(jìn)而激活小三磷酸鳥苷酸酶RhoA和Rac及下游的Rho激酶和JUN激酶[16-18]。PCP途徑主要調(diào)節(jié)細(xì)胞的遷移與極性，該途徑的主要作用可能是在胚胎發(fā)育階段調(diào)控細(xì)胞骨架的重排并參與原腸胚形成[19]。

3 Wnt信號(hào)通路與肺癌干細(xì)胞的關(guān)系

3.1 肺癌干細(xì)胞基因表達(dá)譜與Wnt通路的相關(guān)性 張菁茹等[20]采用干細(xì)胞基因芯片比較受損氣管上皮在恢復(fù)24 h及48 h與正常氣管上皮基因表達(dá)的差異。24 h后差異基因8個(gè)上調(diào)，31個(gè)下調(diào)；48 h后5個(gè)上調(diào)，42個(gè)下調(diào)。差異基因表達(dá)主要集中在細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞連接、FGF、BMP分子、Notch、Wnt信號(hào)通路上。該研究發(fā)現(xiàn)Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路中APC上調(diào)、Axin下調(diào)、cyclin D1上調(diào)，提示細(xì)胞正在增殖，由G0期向S期轉(zhuǎn)變。48 h后主要信號(hào)通路的基因與正常相比仍在向增殖分化方向發(fā)展，48 h后Wnt1下調(diào)意味著向分化方向發(fā)展。

羅福康等[21]對(duì)基因表達(dá)譜進(jìn)行信號(hào)通路分析后發(fā)現(xiàn)，只有Wnt信號(hào)通路與肺腺癌干細(xì)胞密切相關(guān)，并且在肺腺癌干細(xì)胞與正常肺干細(xì)胞中的差異明顯（P＜0.01）。在差異表達(dá)的基因中共有13個(gè)直接或間接參與Wnt通路信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，其中表達(dá)上調(diào)的有8個(gè)，下調(diào)的有5個(gè)。在表達(dá)上調(diào)的基因中TLE2達(dá)到13.1倍，而表達(dá)下調(diào)的基因的改變倍數(shù)沒有超過3倍。目前未見有關(guān)TLE2與腫瘤有直接關(guān)系的報(bào)道，但基因與家族的TLE1、TLE3結(jié)構(gòu)高度相似，功能基因也相近，推測(cè)它通過相似的途徑來抑制肺癌干細(xì)胞的凋亡。

3.2 通過對(duì)關(guān)鍵蛋白質(zhì)的影響抑制肺癌干細(xì)胞發(fā)育及增殖 作為Wnt信號(hào)通路中最關(guān)鍵的通道傳遞分子，β-catenin是一種廣泛存在的多功能胞質(zhì)蛋白質(zhì)。研究[22]表明在肺干細(xì)胞中β-catenin主要通過減弱分化促進(jìn)組織干細(xì)胞數(shù)量的增加，而不是促進(jìn)干細(xì)胞直接增生。

肺癌干細(xì)胞的分子標(biāo)記OCT-4在維持肺癌細(xì)胞的侵襲、克隆形成、耐藥方面有著重要作用[23]。滕穎等[24]研究發(fā)現(xiàn)通過干擾A549細(xì)胞中β-catenin的表達(dá)使細(xì)胞發(fā)生G0-G1期阻滯，抑制細(xì)胞增長(zhǎng)、克隆形成、遷移及耐藥性，肺癌干細(xì)胞標(biāo)志物OCT-4的基因及蛋白表達(dá)均降低；同時(shí)用10 mmol/L的GSK-3β的抑制劑LiCl作用于A549細(xì)胞，β-catenin表達(dá)增加并出現(xiàn)核轉(zhuǎn)移，增殖活性、克隆形成能力、OCT-4表達(dá)均增強(qiáng)。結(jié)果提示以Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑為靶點(diǎn)，抑制此通路在肺腺癌中的活化及其靶基因的表達(dá)，可能成為肺癌分子靶向治療并有可能是針對(duì)肺癌干細(xì)胞治療的新靶點(diǎn)。

Zhang等[25]研究發(fā)現(xiàn)，GATA6通過直接調(diào)控Wnt路徑中的Fzd2蛋白而抑制Wnt路徑。GATA6基因的缺失可以激活Wnt信號(hào)路徑，從而能夠增加細(xì)支氣管肺泡干細(xì)胞的數(shù)量。PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)肺上皮細(xì)胞系MLE-15中利用siRNA對(duì)Fzd2蛋白的表達(dá)進(jìn)行干預(yù)可使Fzd2蛋白表達(dá)減少大約75%，從而導(dǎo)致Wnt信號(hào)通路被激活，促使肺癌的發(fā)生。

癌基因Wnt-1和轉(zhuǎn)移抑制基因mn23-H1同屬于發(fā)育調(diào)控基因，均編碼關(guān)鍵性調(diào)控蛋白，參與細(xì)胞的增殖、分化和凋亡。在受到異常刺激激活或發(fā)生突變表達(dá)出現(xiàn)異常后，又都與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。mn23-H1基因可以通過阻斷Wnt-catenin信號(hào)通路發(fā)揮抑制腫瘤轉(zhuǎn)移作用；而Wnt基因又可能通過Wnt/Ca2+信號(hào)通路影響mn23-H1基因的表達(dá)[26]。

4 展望

盡管目前通過抑制Wnt信號(hào)通路而阻滯肺癌干細(xì)胞的機(jī)制尚未完全闡明，但阻斷Wnt通路仍可能代表新的治療肺癌的策略。由此衍生出多種以Wnt信號(hào)通路為靶點(diǎn)的抗癌治療方法，包括以Wnt信號(hào)、β-catenin為靶點(diǎn)的抗癌治療，通過蛋白質(zhì)阻斷阻止β-catenin表達(dá)，以β-catenin/TCF復(fù)合物的形成及其介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄為靶點(diǎn)的抗癌治療（非甾體類抗炎藥），以β-catenin信號(hào)通路下游基因?yàn)榘悬c(diǎn)的抗癌治療，以及與Wnt/β-catenin信號(hào)通路存在協(xié)同作用的信號(hào)通路為靶點(diǎn)的抗癌治療等[27]。

肺癌干細(xì)胞是腫瘤干細(xì)胞研究中的重要領(lǐng)域，對(duì)于肺癌的生長(zhǎng)起到了至關(guān)重要的作用。Wnt信號(hào)在干細(xì)胞自我更新和增殖分化功能的保持中有著舉足輕重的作用，該信號(hào)途徑各組件突變的終點(diǎn)是干細(xì)胞區(qū)域的不適當(dāng)擴(kuò)增和其分化的子代的增殖，最終在獲得其他變異的情況下導(dǎo)致惡性事件的發(fā)生，形成侵襲性的腫瘤細(xì)胞，是多種惡性腫瘤發(fā)生的重要原因。研究者在日后的研究中可通過比較分析肺癌干細(xì)胞與正常肺細(xì)胞表面分子標(biāo)志的差異，分離、純化肺癌干細(xì)胞的特異性標(biāo)記，通過研究特異性標(biāo)記的Wnt關(guān)鍵蛋白質(zhì)或Wnt通路信號(hào)抑制因子阻斷腫瘤干細(xì)胞的細(xì)胞周期，達(dá)到誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)阻滯或凋亡的目的。