非小細胞肺癌伴神經(jīng)內(nèi)分泌分化的研究進展

戴赟 綜述 韓寶惠 審校

肺癌是最常見的惡性腫瘤，已成為人類因癌癥死亡的主要原因之一。在肺癌治療前明確腫瘤的類型十分重要，因為它和患者的個性化治療密切相關，并能為腫瘤的流行病學及生物學研究提供基礎。目前，肺癌按病理類型分型較多，而且根據(jù)某些形態(tài)學和超微結(jié)構(gòu)，肺癌中還有一些具有神經(jīng)內(nèi)分泌形態(tài)學的腫瘤，能較好地明確肺癌的病理類型及亞型，可以對這些異質(zhì)性肺癌的生物學特性的研究及開展個性化治療提供較多的臨床依據(jù)[1]。近年來發(fā)現(xiàn)，肺癌還伴有神經(jīng)內(nèi)分泌分化（neuroendocrine differentiation, ND），研究證實神經(jīng)內(nèi)分泌分化現(xiàn)象廣泛存在于前列腺、胃腸道、肺等部位的癌中。世界衛(wèi)生組織（World Health Organization, WHO）肺腫瘤組織病理學分類新增加了非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）伴神經(jīng)內(nèi)分泌分化的概念，由于對該類異質(zhì)性肺癌研究較少，許多學者都對其生物學特性和對化療的敏感性及對生存期的影響存在著爭議，本文就神經(jīng)內(nèi)分泌分化標志物的選擇和檢測以及神經(jīng)內(nèi)分泌分化與NSCLC的化療療效、生存期的關系和相關的基因?qū)鴥?nèi)外的研究進展作一綜述。

1 腫瘤的神經(jīng)內(nèi)分泌分化

惡性腫瘤有著許多特征，但基本特征之一是細胞的異常分化。在腫瘤細胞向不成熟方向退行性發(fā)育的過程中，可出現(xiàn)原來組織或器官中的正常細胞所沒有的新的分化特征或原有一些特征的丟失，這種分化不僅給腫瘤的診斷帶來困難，同時也給腫瘤治療造成了許多障礙。腫瘤組織內(nèi)的ND是指腫瘤組織中部分腫瘤細胞出現(xiàn)ND現(xiàn)象，它不同于一般內(nèi)分泌腺腫瘤和神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤。腫瘤組織中這部分ND的腫瘤細胞為腫瘤組織的一種伴隨成分，和神經(jīng)內(nèi)分泌癌區(qū)別為按照WHO分類標準：腫瘤組織中一種神經(jīng)內(nèi)分泌標記物明確陽性，且陽性細胞數(shù)＞50%時診斷為神經(jīng)內(nèi)分泌癌，否則為伴神經(jīng)內(nèi)分泌分化。惡性腫瘤細胞向ND方向分化，但它仍具有惡性特征，即在癌病灶中的ND細胞既顯示腫瘤主體細胞的結(jié)構(gòu)特點，又顯示胞漿內(nèi)分泌顆粒。正常ND細胞具有類似神經(jīng)細胞的致密圓形胞體和大量細長而有分支的樹狀突起。在腺癌病灶中的ND細胞突起缺乏特征性。在低分化腺癌中ND細胞呈圓形、卵圓形或不規(guī)則形，極性消失，這些細胞的胞核與周圍腫瘤一樣具有明顯的異型性。在高分化腺癌中，ND細胞呈錐形或長條形，頂端朝向腺腔側(cè)，有時可見其突起抵達腔面[2,3]。

ND現(xiàn)象已經(jīng)在多種非神經(jīng)內(nèi)分泌器官中得到證實。由于分化的神經(jīng)內(nèi)分泌細胞在癌組織成分中不足50%，且以單個細胞或細胞巢的形式分散存在，為癌組織的一種伴隨成分，被稱為癌伴神經(jīng)內(nèi)分泌分化，從而與神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤相區(qū)別。這些散在的神經(jīng)內(nèi)分泌細胞與其所在器官原發(fā)癌的類型、分期、分級和預后關系密切。許多研究證實，神經(jīng)內(nèi)分泌分化現(xiàn)象廣泛存在于前列腺、胃腸道、肺等部位的腫瘤中。這些分化的神經(jīng)內(nèi)分泌細胞可合成、分泌各種神經(jīng)肽或者胺類激素，致使血液中這些激素類物質(zhì)的水平升高，有時可因激素過剩引起相應的神經(jīng)內(nèi)分泌癥狀，即副神經(jīng)內(nèi)分泌綜合征。除甲狀腺外，胃腸道、前列腺和乳腺、胰腺等組織的正常上皮中均含有神經(jīng)內(nèi)分泌細胞細胞。與正常神經(jīng)內(nèi)分泌細胞的形態(tài)特征類似，分化的神經(jīng)內(nèi)分泌細胞胞漿內(nèi)含有多種致密核心顆粒，它們與存貯和分泌大量內(nèi)分泌活性物質(zhì)有關[4]。

2 肺的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤

自1981年WHO分型公布后，對某些肺腫瘤已有了更進一步的認識，肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的概念被重新界定。肺的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤是一種獨特的亞型，它擁有某些形態(tài)學、超微結(jié)構(gòu)和分子學特征。在組織病理學上能識別的類型有：小細胞肺癌、大細胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌、不典型類癌和類癌。在WHO新分類中將它們統(tǒng)稱為具有神經(jīng)內(nèi)分泌形態(tài)的肺腫瘤。然而，這些腫瘤各有不同的流行病學、發(fā)生學、組織形態(tài)學、分子生物學特性及臨床預后[5]。小細胞肺癌是這類肺癌中最具臨床特點的，其生物學特性和對化療的反應性與大多數(shù)無神經(jīng)內(nèi)分泌分化的肺癌有明顯區(qū)別。從分子生物學的角度看，p53的突變率和/或突變型p53蛋白在小細胞肺癌和大細胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌中的表達率為50%-80%，在典型類癌中不表達，在不典型類癌中僅有10%-20%；在3p、13q14、9p和5q22的雜合子丟失頻率，從不典型類癌到大細胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌和小細胞肺癌也是逐級增加，所以，這種神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤分類具有臨床預后意義[6]。

近年來研究[7]發(fā)現(xiàn)一部分NSCLC中也具有ND特征，國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)其發(fā)生率在10%-30%。約10%-20%的鱗癌、腺癌和大細胞癌具有神經(jīng)內(nèi)分泌分化的特性，在腺癌中最常見，其陽性率與使用的標志物和檢測技術密切相關，這一問題已引起很大的關注。與缺乏ND的NSCLC相比，這類肺癌患者對化放療的敏感性和預后研究的尚不深入，對其生物學行為研究的也較少，故WHO并沒有將其歸入肺癌的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤內(nèi)，而是在1999年“肺與胸膜腫瘤組織病理學分類標準”中，新增加了非小細胞肺癌伴神經(jīng)內(nèi)分泌分化（non-small cell lung carcinomas with neuroendocrine differentiation, NSCLC-ND）的概念。NSCLC-ND是指在光鏡下不具有神經(jīng)內(nèi)分泌形態(tài)特征，但免疫組化和電鏡證明有ND的NSCLC。目前免疫組化標記是檢測ND較好的方法[8]。

3 肺ND特異性標記物

目前公認的ND特異性標記物是嗜鉻蛋白A（chromogranin A, CgA）和突觸素（synaptophysin, SYN）。嗜鉻蛋白是一組相對分子質(zhì)量大小不等的酸性可溶性蛋白質(zhì)，構(gòu)成特異性致密核心顆粒的基質(zhì)，可伴隨ND多肽激素出細胞。CgA是其中之一，它是一種酸性可溶性蛋白，屬于調(diào)節(jié)分泌蛋白家族，由439個氨基酸組成，其編碼基因位于14號染色體。主要儲存在腎上腺髓質(zhì)和多種神經(jīng)內(nèi)分泌細胞的致密核心顆粒中。有研究顯示CgA的表達與致密核心顆粒出現(xiàn)具有一致性。CgA與各種神經(jīng)肽和胺類內(nèi)分泌顆粒及其它神經(jīng)內(nèi)分泌標志物共存，是目前國際公認的特異性較強的神經(jīng)內(nèi)分泌標記物[9]。

相對于CgA來說，SYN的研究更全面。SYN是相對分子質(zhì)量為3.8×104的結(jié)合膜糖蛋白。已發(fā)現(xiàn)哺乳類神經(jīng)系統(tǒng)突觸囊泡膜蛋白至少有15種之多。分子生物學研究揭示這些蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、分布和功能各不相同。目前，研究的最完善的是突觸素。Wiedenmann等[10]在大鼠、小鼠、牛和人腦突觸囊泡膜上識別了又一新的分子量為38,000 Da的必需膜蛋白，并命名它為Synaptophysin。Navone等[11]詳細探討和定量研究了p38在大鼠神經(jīng)組織和非神經(jīng)組織的分布和亞細胞定位。Südhof等[12]采用重組DNA生化技術闡明了p38的分子特征及其基本結(jié)構(gòu)，暗示此蛋白可能構(gòu)成突觸囊泡特異的膜通道。不久Thomas等[13]對p38的四級結(jié)構(gòu)及功能特性進行了研究，證實p38與通道蛋白具有同樣的結(jié)構(gòu)特征，表明其在神經(jīng)遞質(zhì)釋放過程中起重要作用。鑒于p38的分子結(jié)構(gòu)和氨基酸序列的確證，p38的免疫細胞化學及原位雜交技術已廣泛用于動物實驗研究，且有部分用于人類，用來檢測p38的分布以及評估突觸數(shù)量和突觸前終末密度，在臨床方面有潛在應用價值，如神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的診斷，腫瘤發(fā)生來源及疾病機制的探討。突觸素存在于腦、脊髓、視網(wǎng)膜中神經(jīng)元的前突觸囊中，還有腎上腺髓質(zhì)中相似的囊腔中以及神經(jīng)肌接頭處。突觸素因此成為前突觸囊膜的分子標志物，并且在突觸囊腔的形成以及胞吐過程中起作用。突觸素SYN抗體可以標記存在腎上腺髓質(zhì)頸動脈小體、皮膚、垂體、甲狀腺、肺、胰腺、胃腸道粘膜、中樞神經(jīng)、脊髓神經(jīng)以及視網(wǎng)膜中的神經(jīng)內(nèi)分泌細胞。該抗體可以和多種神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤反應，如神經(jīng)母細胞瘤、成神經(jīng)細胞瘤、嗜鉻細胞瘤、非嗜鉻性神經(jīng)節(jié)細胞瘤，還可以和上皮性的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤發(fā)生反應，如呼吸道和胃腸道的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤。

以往的實驗有用NSE、NCAM、TNF受體，ProGPR，LEU-7等作為標記物來檢測NSCLC的ND[14]，但其敏感性和特異性都不如CgA和SYN在NSCLC中高[15]，NSE標記物現(xiàn)在被認為是無幫助的，因為在NSCLC中，2/3 NSE染色陽性，特異性較差。檢測ND的方法很多，如電鏡、免疫組織化學（immunohistochemistry, IHC）測定ND相關的酶和原位雜交檢測編碼ND標志物的mRNA等，Slodkowska等[16]研究認為免疫組化是目前測定ND的標準方法，因為免疫組化在鑒定神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤上無論從形態(tài)學或從診斷到以后的治療，在病理上都是無可取代的方法。

國內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)CgA陽性表達率為10%-30%，SYN陽性率為15%-39%。Sundaresan等[17]認為腺癌伴有ND的發(fā)生率高于鱗癌，低分化癌的ND高于高分化，CgA和SYN一般在腺癌中表達較多， CgA在不同分化程度的腫瘤中表達較接近，而SYN在低分化癌中表達顯著，說明腫瘤分化程度越低，越容易形成ND，產(chǎn)生異質(zhì)性肺癌細胞。

4 NSCLC-ND對患者生存期的影響

對肺癌術后生存情況的預測，目前較明確的依據(jù)是腫瘤的生物學特性[18]。越來越多的學者致力于對肺癌伴神經(jīng)內(nèi)分泌分化現(xiàn)象的研究，分析它們與肺癌惡性程度的關系，以指導對肺癌預后的治療[19,20]。NSCLC-ND對預后的影響在國外一直有爭議。Pelosi等[21]對220例I期的NSCLC研究發(fā)現(xiàn)，ND超過腫瘤細胞5%的患者預后較差，I期NSCLC伴ND患者生存期較無ND的NSCLC低，且有明顯差異。他們在220例I期NSCLC患者中，用光鏡和IHC檢測CgA、Syn和呼吸道相關激素，其中28例為NSCLC伴ND，包括5例腺癌和13例鱗癌患者。5年的隨訪所獲結(jié)論為NSCLC伴ND特別是病理為腺癌且超過5%腫瘤細胞有ND特性的患者，其生存期比普通的NSCLC患者短（P=0.017），預后差。而Howe等[22]對439例NSCLC患者的研究提示無論采用手術還是化療的NSCLC患者，他們的生存期與神經(jīng)內(nèi)分泌分化無關，因此Howe認為不能用現(xiàn)有的檢測ND的免疫化學指標（包括CgA、Syn和NCAM）對NSCLC疾病進行預后評價。Nisman等[23]研究了67例晚期NSCLC發(fā)現(xiàn)治療前CgA高表達不利于生存。ND是影響生存期的獨立因素。Graziano等[24]檢測了260例手術切除的I期、II期NSCLC患者的NSE、CgA、Leu-7和Syn等標志物，結(jié)果顯示NSE的陽性率為70%，CgA為14%，Leu-7為8%和Syn為11% ，其中61例患者有2個或2個以上ND標志物陽性。1個ND標志物陽性與2個或2個以上ND標志物陽性患者相比無病生存期無差異。這幾項研究結(jié)果的不一致，可能由于各研究中化療方案有差異，另一方面研究的NSCLC臨床分期也不一致，肺癌細胞在早晚期的異質(zhì)性差異也有可能使得研究結(jié)果有所差異。由于可能存在其它影響生存期的混雜因素，Gonzalez等[25]把病例限制在Ia期和Ib期的鱗癌和腺癌手術患者中，避免了亞型的混雜因素的干擾，主要研究SYN的表達，發(fā)現(xiàn)SYN陽性表達的患者腫瘤更具侵襲性，預后更差。Ionescu等[26]研究了更多的肺癌標本，得出的結(jié)果卻是ND不能作為預后的判斷指標，由于其文章中未列出肺癌的分期情況，其病例中還包括癌肉瘤和巨細胞癌，其結(jié)果還待多中心臨床試驗來明確。Gregorc等[27]使用ELISA和IHC的方法來檢測CgA和TNF在晚期NSCLC患者血中的濃度和蛋白的表達情況，發(fā)現(xiàn)血清CgA和腫瘤組織中的CgA均能作為預后的預測因子。CgA血清濃度越高和蛋白表達陽性率越高，NSCLC患者預后越差。雖然以上幾項研究的結(jié)果不全一致，但綜合幾項研究的結(jié)果，ND還是對NSCLC患者的生存期有著一定的影響。

5 影響ND的基因

目前對ND現(xiàn)象的研究大多停留在蛋白的水平，關于ND相關基因以及這些基因在ND中作用機制的研究甚少。Kazanjian等[28]報道hASH1與肺癌中的ND存在一定的關系。研究顯示hASH1在調(diào)節(jié)肺癌ND中具有獨立性作用，體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，hASH1在神經(jīng)內(nèi)分泌細胞和發(fā)生ND的細胞中呈陽性表達，此外還發(fā)現(xiàn)hASH1在具有ND的肺癌中呈特異性表達，并在調(diào)節(jié)肺癌ND中也具有很重要的作用，這些均說明hASH1與肺癌ND具有相關性。Jiang等[29]研究hASH1在胚胎早期的神經(jīng)和肺的發(fā)育中呈短暫性表達，但是當這些細胞分化成熟、神經(jīng)表型出現(xiàn)后hASH1的表達立即消失，并發(fā)現(xiàn)hASH1的表達與組織分化的程度相關，并廣泛存在于低分化的腺癌組織中，這些均表明，hASH1在腺癌組織的ND中具有重要的作用。Osada等[30]認為雖然hASH1在肺癌的ND起著重要作用，但進一步研究發(fā)現(xiàn)其功能不過是作為一個轉(zhuǎn)錄因子來激活ND，這個蛋白通過ASH1介導脫去乙酰基來抑制DDK1、DKK3和負調(diào)節(jié)Wnt/beta-catenin和E-cadherin的信號傳導。

Mountzios等[31]認為腫瘤抑制基因TP53和RB1的點突變和ND有關，雖然這種突變在各種肺癌的病理組織都可見，但是其突變的頻率和發(fā)生的“時機”在NSCLC和有ND的小細胞肺癌中明顯不同。 D'Alessandro等[32]分析了20個新鮮的肺部的腫瘤組織，認為n-ELAV也稱為Hu抗原，其基因的改變和肺部腫瘤的ND的開始以及后續(xù)的一系列侵襲變化密切相關。

6 展望

惡性腫瘤細胞朝神經(jīng)內(nèi)分泌方向的分化是腫瘤細胞在侵襲演進過程中的一種分化，還是腫瘤組織本身所具有的一種非特異性的變化，值得我們繼續(xù)探討。ND發(fā)生可能涉及到眾多調(diào)控環(huán)節(jié)，但具體的調(diào)控位點仍然是未知，因此對惡性腫瘤伴ND發(fā)生發(fā)展機制的研究有重要的理論價值。在NSCLC中進一步研究ND現(xiàn)象，對于其生物學特性和亞型的研究，尋求預防惡性腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移、防止腫瘤細胞抗藥性及研制誘導分化的新的治療方法及藥物，都有著重要意義。