DNA損傷修復與肺癌順鉑耐藥機制的研究進展

唐春蘭 綜述 楊和平 周向東 審校

肺癌是目前世界上發病率及死亡率最高的惡性腫瘤，研究[1]表明，至少有40%的肺癌患者在確診時已為晚期，僅有約25%的患者為I期，而對于晚期及部分中期及術后患者，化療是治療的主要手段之一。盡管對肺癌的化學治療取得了一定的進展，但過去25年其5年生存率仍未見明顯提高，約為15%[2]。肺癌的化療是以鉑類為基礎的聯合化療，其中，順鉑（cis-dichlorodiamine platinum,cisplatin, CDDP）是有效并廣泛應用的一線藥物，但是由于耐藥問題的存在使其療效不盡如人意。

順鉑是一種細胞周期非特異性細胞毒藥物，含有類似烷化劑的雙功能基團，與細胞內親核基團結合，無選擇地分布在腫瘤組織中，其主要作用靶點是DNA。順鉑進入腫瘤細胞后水解為雙氯雙氨鉑，然后與細胞DNA形成順鉑-DNA加合物，通過DNA-Pt-DNA結構形成DNA鏈內交聯、鏈間交聯或通過DNA-Pt-蛋白質形成DNA-蛋白交聯，破壞DNA的正常結構，阻礙DNA的模板作用，進而抑制DNA的復制和轉錄，誘導細胞凋亡[3,4]。因此，DNA損傷修復功能的異常是順鉑耐藥的主要機制之一。

DNA損傷修復系統在抗癌過程中起到極為重要的作用，其功能增強會使腫瘤細胞對化療藥產生拮抗，使化療失敗[5]，同時受損DNA的異常修復可能會增加患癌癥的風險。機體對DNA的損傷修復包括：①直接修復（direct repair, DR）：修復O6-烷基-鳥嘌呤引起的損傷；②堿基切除修復（base excision repair, BER）：針對氧化還原或烷基化引起的堿基損傷；③核苷酸切除修復（nucleotide excision repair, NER）；④DNA錯配修復（mismatch repair, MMR）；⑤DNA雙鏈斷裂損傷修復；⑥跨損傷修復（translesion synthesis, TLS）。本文主要綜述與肺癌順鉑耐藥相關的DNA損傷修復異常。

1 NER

DNA的損傷修復過程包括損傷識別、切開、切除、修復合成和DNA連接等5個步驟，NER的修復通過切除藥物或者紫外線等損傷的DNA而形成的DNA加合物，以互補鏈為模板復制并修復損傷DNA來維護基因組的完整性。其中，DNA損傷的識別/切除為限速步驟。

1.1 切除修復交叉互補基因1（excision repair crosscomplementing gene 1, ERCC1） ERCC1位于染色體19q13.2，基因全長15 kb，編碼含297個氨基酸的蛋白質，ERCC1與XPF形成的異二聚體具有5′DNA核酸內切酶活性，具有損傷識別和切除5′端的雙重作用，在NER中起到限速或調節的重要作用[6]，其活性的高低可反映整個NER修復活性的水平[7]。ERCC1過表達可使停滯在G2/M期的損傷DNA迅速修復，尤其是ERCC1能使順鉑誘導的DNA絡合物的清除增加，導致其對順鉑耐藥。此外，研究[8,9]表明，ERCC1-XPF復合物也可以通過同源組合修補DNA雙聯斷裂損傷從而引起肺癌順鉑耐藥。

研究[10,11]表明，ERCC1在肺癌組織和細胞系中均存在過表達，其表達水平以肺鱗癌最高，而肺腺癌最低。Arora等[9]采用RNA干擾的方法降低非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）細胞中ERCC1-XPF的表達，發現XPF蛋白水平隨ERCC1下調而減低，順鉑誘導的DNA損傷修復能力隨XPF、ERCC1、ERCC1-XPF表達的下調而降低，鏈內交聯引起的DNA雙鏈斷裂在XPF-ERCC1缺失時持續存在，進一步研究發現，ERCC1-XPF復合物抑制的細胞活性減弱，對順鉑敏感性增加，且同時抑制XPF和ERCC1較單獨抑制XPF或ERCC1細胞毒性更強。在臨床研究中也發現，ERCC1的表達水平與肺癌以鉑類（主要是順鉑）為基礎的化療臨床結果負相關。Wang等[12]應用免疫組化方法檢測了ERCC1在124例晚期NSCLC的石蠟切片的表達情況，回顧性地分析了它們對以鉑類為基礎的化療患者的化療有效性及生存期的預測作用。結果顯示，ERCC1的陽性表達率為35%（43/124），ERCC1的表達與腫瘤對化療的反應負相關，沒有表達ERCC1的患者部分緩解率為54%，而表達該蛋白的患者僅為33%，具有統計學意義（P=0.022），進一步分析，缺乏ERCC1表達的患者具有更長的中位生存期（13.4個月 vs 9.1個月，P=0.006 ）。Li等[13]通過對66例晚期NSCLC未治療前經支氣管肺活檢標本中ERCC1 mRNA表達水平檢測得出結論，ERCC1低表達接受以順鉑為基礎的化療效果較好，總生存期（overall survival,OS）延長。但是，對于不予化療的肺癌患者，ERCC1的陰性表達可能為生存預后較差的指標。Olaussen等[14]采用免疫組化方法檢測了國際肺癌臨床試驗入組的761例NSCLC患者手術切除腫瘤組織中的ERCC1的表達情況，其中ERCC1陽性335例（44%），ERCC1陰性426 例（56%）。ERCC1陰性的患者隨機接受輔助化療明顯延長生存時間（P=0.002）；ERCC1陽性患者無論是否接受輔助化療與否，生存情況沒有統計學差異（P=0.400）；對于沒有接受輔助化療的患者，ERCC1陽性患者生存時間長于ERCC1陰性患者（P=0.009）。因此他們認為：手術完全切除的ERCC1陰性的NSCLC患者更適合基于順鉑的輔助化療；對于未予輔助化療的患者，ERCC1陰性是預示著較短生存期的獨立預后因素。以上研究表明，ERCC與肺癌順鉑原發耐藥相關，同時也說明ERCC1在肺癌中具有雙重作用，此與近年認為DNA損傷修復是雙刃劍的理論相符。此外，ERCC1基因的多態性也能影響肺癌順鉑耐藥[15]。

1.2 核糖核苷酸還原酶M1（ribonucleotide reductase, RRM l） RRM1是核苷酸還原酶的組成部分，而核苷酸還原酶是脫氧核苷酸產生的關鍵酶，是DNA合成與修補必需酶[16]，也是DNA合成及修復的限速酶，其基因定位于染色體11p15.5。在NER途徑中順鉑加合物導致的核苷酸損害，所造成的間隙由RRM1提供的DNA合成前體所充填，執行分裂溝填充的功能。此外RRM1還參與吉西他濱代謝。

目前認為，RRM1是判斷NSCLC惡性行為的一個生物學和臨床的重要指標。RRM1是腫瘤抑制基因[17]，其表達可抑制腫瘤細胞增殖。Bepler等[18]研究表明，在多因素分析中，RRM1表達是預測生存延長的指標，RRM1與PTEN表達增高的患者與表達降低的患者相比較其生存延長，復發延遲。但在化療損傷后DNA修補期間，卻發現人類RRM1被上調[19]，但卻對化療的反應性下降。Wang等[12]應用免疫組化方法檢測了RRM1在124例晚期NSCLC的石蠟切片的表達情況，回顧性的分析了它們對以鉑類為基礎的化療患者的化療有效性，結果顯示RRM1的陽性表達率為40%（50/124），且RRM1的表達與腫瘤對化療的反應負相關，沒有表達RRM1的患者部分緩解率為54%，而表達該蛋白的患者僅為36%，具有統計學意義（P=0.042）。然而，盡管RRM1高表達的晚期NSCLC患者接受以吉西他濱+順鉑化療具有更差的臨床結果，但是接受手術的NSCLC患者，RRM1高表達則具有更長的生存期[15]。以上研究說明RRM1可能與順鉑的獲得性耐藥相關。

2 DNA錯配修復

MMR是細胞復制后一種修復機制，該系統的主要功能是修復DNA的堿基錯配損傷，以保持DNA忠實復制，控制基因突變，在保持基因的完整性上具有重要作用。目前共發現人類有9種錯配修復基因（human mismatch repair genes, hMMR genes），即hMLH1、hMLH3、hMSH2、hMSH3、hMSH4、hMSH5、hMSH6、hPMS1和hPMS2。其中，hMLH1和hMSH2的作用最為重要[3]。

研究[20-22]表明，在肺癌組織中普遍存在錯配修復基因的低表達，尤其是在吸煙的男性患者中更為突出，提示DNA錯配修復功能的缺陷與肺癌的形成有關。此外，錯配修復基因的表達也與肺癌順鉑耐藥相關。Scartozzi等[23]應用免疫組化方法檢測了93例晚期NSCLC腫瘤標本中hMLH1和hMSH2的表達情況，所有的患者均接受順鉑或奧沙利鉑與吉西他濱的聯合化療，結果顯示，缺失hMSH2表達的患者，奧沙利鉑+吉西他濱組的化療應答率為38%，而順鉑+吉西他濱組完全無效，提示對hMSH2缺失對順鉑耐藥；最近，Cheng等[24]研究報道了hMSH2和hMLH1單核苷酸多態性與接受以鉑類（順鉑或卡鉑）為基礎化療的晚期NSCLC患者對化療反應的關系。一共對96例中國晚期NSCLC患者進行了檢測，取其外周血淋巴細胞通過三維聚丙烯酰胺凝膠脫氧核糖核酸微陣列方法分析hMSH2 gIVS12-6T/C和hMLH1-1151T/A與化療的關系，結果發現，hMSH2 gIVS12-6T/C化療效果更好。吳等[25]研究了hMLH1基因啟動子甲基化與NSCLC細胞順鉑耐藥的關系。他們選擇A549親代及順鉑耐藥細胞株進行研究，結果顯示，hMLH1 mRNA在A549中的表達高于A549/DDP細胞，A549細胞hMLH1為非甲基化狀態，A549/DDP細胞為部分甲基化狀態，經5-氮雜-2’-脫氧胞苷（5-Aza-CdR）去甲基作用后，hMLH1呈非甲基化狀態；A549組、A549/DDP組、經10 μmol/L 5-Aza-CdR干預后的A549/DDP組經順鉑作用后的IC50值分別為（4.7±0.7）μmol/L、（30.1±1.8）μmol/L和（6.9±0.6）μmol/L；5-Aza-CdR干預后的A549/DDP細胞經順鉑作用后，比單用順鉑抑制A549/DDP細胞的凋亡形態學改變明顯，凋亡小體以及核固縮現象增多，因此作者認為：hMLH1甲基化可能參與了A549/DDP細胞的順鉑耐藥過程；5-Aza-CdR能抑制hMLH1甲基化，恢復hMLH1表達，并能增強順鉑對A549/DDP細胞增殖抑制和凋亡。

3 DNA雙聯斷裂修復

BRCA1（breast cancer type 1 susceptibility gene）作為一種抑癌基因，其表達的蛋白具有重要的生物學功能，包括細胞周期調控、DNA損傷修復、基因的轉錄調節、細胞凋亡和泛素化等。BRCA1與MRE1/RAD50/NBS1復合物相互作用，共同參與DNA雙鏈斷裂修復。另有研究還表明BRCA1通過c-JNκ通路參與細胞周期的調控與凋亡[26]，而這些機制都可能與順鉑的耐藥相關，阻止該通路會增加細胞株對順鉑的敏感性[27]。

Miquel等[28]對接受了吉西他濱/順鉑新輔助化療的NSCLC手術患者進行研究，發現BRCA1 mRNA表達水平與患者中位生存期明顯相關，BRCA1在NSCLC中高表達患者的生存期明顯縮短。尤其是四分位分組時，BRCA1表達最低組的中位生存期還沒能得出，中間兩個組的中位生存期為37.9個月，最高組為12.7個月。Rosell等[29]在126例可切除NSCLC患者的9個基因mRNA檢測中，僅有BRCA1 mRNA的表達是III期NSCLC獨立的預后因素；40例BRCA1高表達患者中位生存期29個月（22.2個月-35.7個月），而83例BRCA1低表達者尚未達到，提示BRCA1高表達是預后差的標志。既往實驗[30]表明BRCA1過表達可以增加多西紫杉醇的敏感性而對順鉑耐藥，Rosell等[31]在臨床試驗中也得出相似的結果，他們根據123例已發生轉移的非鱗癌NSCLC腫瘤標本中BRCA1 mRNA的表達情況選擇不同的化療方案，低表達者選擇順鉑+吉西他濱，中表達者選擇順鉑+多西紫杉醇，高表達者選擇多西紫杉醇，結果顯示2年生存率分別為41.2%、15.6%和0，提示BRCA1的高水平表達可能會降低以順鉑為基礎的聯合化療的2年生存率，而部分原因可能是由于BRCA1高水平表達者對順鉑耐藥，因此可根據BRCA1的表達水平制定化療方案。

4 TLS

盡管順鉑導致的DNA損傷可以通過核苷酸切除修復及鏈內交聯修復去除，但仍有一些損傷存在。細胞忽略容忍未修復的DNA損傷的機制就是TLS，它是由一組專門的DNA聚合酶來執行的，TLS聚合酶可以繞過未修復的DNA損傷繼續進行DNA復制。哺乳動物細胞的TLS聚合酶包括polη（POLH）、polι（POLI）、polκ（POLK）、REV1和polζ （REV3和REV7），每個酶都有專門的作用底物，對順鉑而言，polη和polζ可以繞過順鉑-GG加合物繼續進行DNA復制[32,33]。

TLS耐受順鉑導致損傷的重要性在TLS聚合酶活性缺失的細胞得到明顯的體現。對包括肺癌細胞在內的人細胞系中polη活性進行檢測，發現polη活性缺失的細胞對順鉑導致的DNA損傷增加，對順鉑更為敏感[34,35]。在另一項研究[36]中也發現，比較polη缺失的細胞和用補體致活polη的同樣細胞對順鉑、卡鉑、奧沙利鉑的敏感性，發現前者更敏感。在臨床研究中，Ceppi等[37]檢測了72例NSCLC患者的石蠟包埋腫瘤標本的polη mRNA的表達情況，所有患者均接受以鉑類為基礎化療，發現polη的表達水平與患者的生存時間呈負相關，高表達者生存時間明顯短于低表達者（6.9個月 vs 21.1個月，P=0.003），進一步說明其與肺癌順鉑耐藥的相關性。

5 結語

肺癌順鉑耐藥是由多因素多因子參與的，任何一種機制都不可能完全解釋肺癌順鉑耐藥現象的發生，而且，一些在臨床前研究確認的肺癌順鉑耐藥相關因子在臨床應用中的意義尚未完全闡明，有的是剛剛開展。因此，一方面，有必要對肺癌順鉑耐藥機制繼續進行縱深研究；另一方面，可以根據目前已經得到的研究結果制定相應的方案克服肺癌順鉑耐藥，如ERCC1、BRCA1的表達水平的不同直接影響NSCLC患者應用順鉑化療敏感程度及預后，因此可以根據基因的表達情況來選擇性用藥，但目前這些研究還是比較初步的，雖然已開始了一些前瞻性研究[38]，但大多基于回顧性的研究結果。此外，順鉑與一些靶向藥物的聯合應用也是克服其耐藥的方法之一，如VEGF單克隆抗體貝伐珠單抗與順鉑+吉西他濱聯合應用治療非鱗NSCLC，可提高化療反應性并延長患者生存時間[39]。最后，可以開發新的鉑類藥物來克服順鉑的耐藥，這些藥物與順鉑部分或完全沒有交叉耐藥[40,41]。例如，奧沙利鉑由于細胞攝入機制不同（較少依賴于Ctr1）可以導致細胞內藥物濃度減少及MMR蛋白不能識別奧沙利鉑誘導的DNA損傷從而缺乏交叉耐藥性[42]；Satraplatin和picoplatin在NSCLC中也顯示出較好的臨床活性[41]；Tang等[43]報道picoplatin可以通過提高細胞內的藥物濃度對耐順鉑和卡鉑的NSCLC仍然具有細胞毒性，最近的一項II期臨床實驗[44]也表明picoplatin對耐其他鉑類藥物的SCLC顯示出較好的臨床效果。相信隨著肺癌順鉑耐藥機制研究的深入長期困擾肺癌化療的耐藥問題必將得以解決。