CD82/KAI1和HIF-1α在非小細胞肺癌中的表達及其與血管生成擬態的關系

武世伍 承澤農 俞嵐 宋文慶 陶儀聲

CD82/KAI1基因是一個新的腫瘤轉移抑制基因，該基因位于染色體11p11.2，編碼產物為細胞膜糖蛋白，屬于4次跨膜蛋白超家族（transmembrane 4 superfamily,TM4SF）家族成員，廣泛表達于多種組織。其表達與多種腫瘤的演進和預后及胚胎的植入密切相關[1,2]。缺氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α）是缺氧條件下廣泛存在于哺乳動物和人體內的一種轉錄因子，是應答缺氧應激的關鍵基因，它的活性對腫瘤細胞凋亡、轉移及血管生成等生物學行為起著重要作用。血管生成擬態（vasculogenic mimicry, VM）是Yue[3]發現的一種獨特的腫瘤血液供應方式，即是一種由腫瘤細胞變形并形成可輸送血液的管道結構，對緩解腫瘤缺氧起重要作用。VM的存在與疾病進展和預后不良相關。本研究通過檢測160例非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）病例標本CD82/KAI1、HIF-1α的表達和VM，旨在尋找能預測NSCLC患者局部浸潤、淋巴結轉移及術后生存率的指標。

1 材料與方法

1.1 一般資料 收集蚌埠醫學院第一附屬醫院病理科2003年1月-2005年4月存檔石蠟包埋NSCLC組織標本160例（術前未行放、化療）和正常肺組織標本20例，所有病例均有完整的臨床、病理及隨訪資料，入選病例隨訪至患者死亡或截至2010年4月，隨訪時間為3個月-84個月。其中男性130例，女性30例；從大體類型看，中央型120例，周圍型40例；鱗癌116例（高分化17例，中分化71例，低分化28例），腺癌44例（高分化4例，中分化32例，低分化8例）。年齡26歲-82歲，中位年齡59.6歲，≥60歲者86例，＜60歲者74例；腫瘤長徑D≥3.0 cm者145例，D＜3.0 cm者15例；按淋巴結有無轉移，有轉移76例，無轉移84例。根據UICC2002版pTNM病理分期標準進行分期，其中I期患者31例，II期患者43例，III期患者34例，IV期患者52例。對照組正常肺組織20例取自肺癌腫塊＞5.0 cm的肺組織，病理HE染色證實為正常肺組織。

1.2 試劑 鼠抗人CD82/KAI1單克隆抗體（克隆號：G-2）、鼠抗人HIF-1α單克隆抗體（產品編號：SC-53546）購自Santa Cruz公司；鼠抗人CD34單克隆抗體（產品編號：MAB-0034，克隆號QBEnd/10）、ElivisionTMplus試劑盒以及DAB顯色試劑盒均購自福州邁新生物技術開發公司。PAS染色液為蚌埠醫學院第一附屬醫院病理科配制。

1.3 實驗方法

1.3.1 采用免疫組織化學ElivisionTMplus法 將石蠟標本以4 μm厚連續切片、烤干，于二甲苯溶液及不同濃度的乙醇中脫蠟至水洗。免疫組化染色操作步驟按試劑盒說明書進行。采用已知陽性片作對照，以PBS液代替一抗作空白對照。

1.3.2 CD34和PAS套染 CD34染色，DAB顯色后，流水沖洗1 min終止顯色反應，PAS染色按照《臨床技術操作規范——病理學分冊》說明進行。

1.3.3 微血管密度（microvessel density, MVD）計數 CD34主要表達在血管內皮細胞的細胞漿和胞膜，從而可以通過CD34的陽性表達來進行MVD計數，參照修改過的Weidner[4]法來計數。

1.4 結果判定 CD34和CD82/KAI1均以細胞膜和細胞漿出現棕黃色顆粒為陽性；HIF-1α蛋白以細胞核內和胞漿有棕黃色細顆粒為陽性。采取二次計分法：每例標本隨機計數5個高倍視野（×400），計數每個高倍視野中陽性細胞所占百分比并計分。首先將染色強度計分：0分為無色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。再將陽性細胞百分比計分，0分為陰性，1分為陽性細胞為＜10%，2分為11%-50%，3分為51%-75%，4分為＞75%。用染色強度得分和細胞數得分的乘積作為判斷表達結果，若積分≤1為陰性，＞1為陽性。免疫組化結果由高年資病理醫師讀片評定。

1.5 統計分析 采用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析。CD82/KAI1、HIF-1α和VM表達陽性組與陰性組生存分析用Kaplan-Meier法，組間比較用Log-rank檢驗，多因素分析采用Cox回歸多因素模型，在NSCLC組織中，CD82/KAI1、HIF-1α的表達和VM與正常肺組織、各臨床及病理因素的相關性采用χ2和Spearman等級相關檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NSCLC中存在VM HE染色光鏡下可見由腫瘤細胞圍成的管道樣結構，無內皮細胞襯覆，管腔內不見壞死的腫瘤細胞及炎癥細胞。經CD34與PAS雙重染色，管腔呈現CD34陰性但PAS陽性的結構，即VM（圖1A，圖1B）；此外，還能見到網絡狀的VM。160例NSCLC標本中，36.9%（59/160）可見由CD34陰性的腫瘤細胞圍成的管道樣或網絡狀的結構，而PAS陽性，一層PAS陽性物質將腫瘤細胞和管腔分開。正常肺組織中未見有VM現象。

2.2 NSCLC中的VM與臨床病理的關系 VM陽性在患者的性別、年齡、組織學類型等之間的差異無統計學意義（P＞0.05）。隨著NSCLC的分化越差，VM的陽性越強，差異有統計學意義（P＜0.01），pTNM分期I期-II期VM陽性率為4.1%（3/74），III期-IV期VM陽性率為65.1%（56/86），VM組的pTNM分期與無VM組的pTNM分期相比差異有統計學意義（P＜0.01），且VM組的患者更易發生淋巴結轉移（P＜0.01）（表1）。

2.3 NSCLC中CD82/KAI1的表達及其與臨床病理的關系CD82/KAI1主要定位于NSCLC癌細胞膜，胞漿也有一定表達，呈棕黃色。正常肺組織中CD82/KAI1陽性顆粒主要位于細胞漿和膜（圖1F）。在NSCLC中，CD82/KAI1的陽性率為37.5%（圖1C，圖1D，圖1E），較正常肺組織的表達率（19/20）明顯減少（P＜0.01）。CD82/KAI1的表達與患者性別、年齡及組織學類型無相關性（P＞0.05）。隨著NSCLC的分化越差，CD82/KAI1的表達越低，差異有統計學意義（P＜0.01）；CD82/KAI1的陽性表達與淋巴結轉移有關（P＜0.01）；I期-II期腫瘤中CD82/KAI1的陽性率為66.2%（49/74），III期-IV期腫瘤中CD82/KAI1的陽性率為12.8%（11/86），兩者之間差異具有統計學意義（P＜0.01）（表1）。

2.4 NSCLC中HIF-1α的表達及其與臨床病理的關系 HIF-1α主要表達于NSCLC癌細胞核，棕黃色，在胞漿中也有少量表達。對照組未見有HIF-1α表達（圖1J），在NSCLC中HIF-1α蛋白陽性表達率為48.8%（圖1G，圖1H，圖1I），其表達與NSCLC的分化程度、淋巴結轉移及臨床分期有關，即隨著HIF-1α表達越高，腫瘤的分化越差、臨床分期越晚、更易發生淋巴結轉移（表1）。

2.5 NSCLC中CD82/KAI1、HIF-1α的表達和VM情況以及它們的關系 在VM陽性組的病例中，CD82/KAI1陽性率為3.4%（2/59）；在CD82/KAI1陽性表達的病例中，VM的陰性率為96.7%（58/60），差異有統計學意義。Spearman相關分析顯示， CD82/KAI1在NSCLC中的表達與VM呈負相關（r=-0.539, P＜0.01）。從表2可以看出，CD82/KAI1與HIF-1α的表達呈負相關（r=-0.704, P＜0.01），HIF-1α的表達與VM 呈正相關（r=0.654, P＜0.01）。

2.6 MVD與CD82/KAI1、HIF-1α、VM的關系 Spearman相關分析顯示，CD82/KAI1的表達與MVD呈負相關（r=-0.596, P＜0.01）；VM的陽性與MVD呈正相關（r=0.747, P＜0.01）；HIF-1α的表達與MVD呈正相關（r=0.716, P＜0.01）（表2）。

2.7 多因素分析 將病理組織分化（分為高分化組、中分化組與低分化組），年齡（分為≥60歲組與＜60歲組）、pTNM分期（分為I期+II期組與III期+IV期組）、腫瘤直徑（分為≥3.0 cm組與＜3.0 cm組）、腫瘤位置（分為中央型組與周圍型組）、淋巴結轉移（分為有轉移組與無轉移組）、性別（男性組與女性組）、VM（分為陽性組與陰性組）、MVD（因為MVD的均值為22.42±12.8，故以MVD＜22為陰性，MVD≥22為陽性）；CD82/KAI1（分為表達陽性組與陰性組）和HIF-1α（分為表達陽性組與陰性組）等因素引入Cox模型進行多因素分析，結果顯示：CD82/KAI1與HIF-1α的表達和VM及pTNM分期是影響NSCLC患者預后的獨立因素（表3）。

2.8 生存分析 本組病例總的5年生存率為26.9%。Kaplan-Meier生存分析顯示VM陽性組與陰性組5年生存率分別為1.7%（1/59）和41.6%（42/101），差異有統計學意義（P＜0.01，圖2A）；CD82/KAI1陽性組與陰性組5年生存率分別為68.3%（41/60）和2.0%（2/100），差異有統計學意義（P＜0.01，圖2B）；HIF-1α陽性組與陰性組5年生存率分別為3.8%（3/78）和48.8%（40/82），差異有統計學意義（P＜0.01，圖2C）；MVD≥22和MVD＜22的5年生存率分別為2.9%（2/69）和45.1%（41/91），差異有統計學意義（P＜0.01，圖2D）。

3 討論

部分高侵襲性腫瘤存在一種不依賴血管內皮細胞，而是由腫瘤細胞通過自身變形和細胞外基質重塑直接圍成的管道樣結構，并可與宿主靜脈相通，以獲取血供，即血管生成擬態-VM[5]。VM的提出不僅對傳統的血管生成理論提出了挑戰，同時也是對腫瘤血管形成理論的重要補充。Folberg等[6]在葡萄膜黑色素瘤中定義了幾種形態的VM，即有的呈直的或平行排列的或十字交叉的直線型、有或無分支的弧形、封閉的環形、網絡狀等結構，這些結構都呈現PAS陽性而CD34陰性。后來在肝癌[7]、卵巢癌[8]、前列腺癌[9]及雙分化腫瘤[10]等高度惡性腫瘤中都報道有VM的存在。

圖 1 VM、CD82/KAI1和HIF-1α在NSCLC中的陽性染色以及對照組中的染色。A、B：NSCLC中VM陽性染色（黑箭頭所示為VM結構，紅箭頭所示為血管，A和B為低分化鱗癌，ElivisionTM×400）；C、D、E：NSCLC中CD82/KAI1表達陽性，主要表達于細胞膜和細胞漿（C為中分化鱗癌，D為低分化鱗癌，E為高分化鱗癌，ElivisionTM×400）；F：對照組中CD82/KAI1表達陽性，主要表達于細胞漿和細胞膜（為正常支氣管腺，ElivisionTM×400）；G、H、I：NSCLC中HIF-1α表達陽性，主要表達于細胞核和細胞漿（G為低分化腺癌，H為中分化鱗癌，I為中分化腺癌，ElivisionTM×400）；J：對照組中HIF-1α表達陰性（正常肺組織，ElivisionTM×100）。Fig 1 Positive staining of VM, CD82/KAI1 and HIF-1α in NSCLC and staining in the control group. A,B: positive staining of VM in NSCLC (black arrow is VM, red arrow is vessel, A and B are poor differentiation squamous carcinoma, ElivisionTM×400)； C,D, E: positive staining of CD82/KAI1 in membrane and plasma of NSCLC (C is mediate differentiation squamous carcinoma, D is poor differentiation squamous carcinoma, E is well differentiation squamous carcinoma, ElivisionTM×400)； F: positive staining of CD82/KAI1 in plasma and membrane of the control group (normal bronchial glands, ElivisionTM×400)； G, H, I: positive staining of HIF-1αin nuclei and plasma of NSCLC (G is poor differentiation adenocarcinoma, H is mediate differentiation squamous carcinoma, I is mediate differentiation adenocarcinoma, ElivisionTM×400)； J：negative staining of HIF-1α in the control group (J is normal lung tissue, ElivisionTM×100). VM：vasculogenic mimicry；HIF-1α：hypoxia inducible factor-1α；NSCLC：non-small cell lung cancer.

圖 2 VM、CD82/KAI1、HIF-1α和MVD陽性組與陰性組NSCLC患者生存曲線。A：VM陽性組與陰性組NSCLC患者生存曲線；B：CD82/KAI1表達陽性組與陰性組NSCLC患者生存曲線；C：HIF-1α表達陽性組與陰性組NSCLC患者生存曲線；D：MVD≥22組與＜22組NSCLC患者生存曲線。MVD：microvessel density。Fig 2 Survival curves of NSCLC patients with positive or negative group VM,CD82/KAI1, HIF-1α and MVD. A: survival curves of NSCLC patients with positive or negative VM group； B: survival curves of NSCLC patients with positive or negative CD82/KAI1 expression； C: survival curves of NSCLC patients with positive or negative HIF-1αexpression； D: survival curves of NSCLC patients with MVD≥22 group or＜22 group.

本研究在59例NSCLC中發現了符合具有VM標準的結構，證實NSCLC中有VM的存在。VM結構由腫瘤細胞圍成，腫瘤細胞與血流之間僅有一層PAS陽性物質相隔，無血管內皮細胞屏障，導致了腫瘤患者具有轉移早、轉移率高、患者臨床預后差，死亡率高等特點。本研究也顯示VM與腫瘤分化程度、淋巴結轉移與否及臨床分期等密切相關。即有VM的腫瘤具有更差的分化、更低的臨床分期以及更易發生淋巴結轉移。

HIF-1α基因位于14號染色體，編碼826個氨基酸。當細胞缺氧時，HIF-1α在細胞核內高表達。HIF-1α可通過調控多種靶基因表達以逃避或適應相對缺氧環境，參與腫瘤生長、浸潤和轉移[11]。本研究結果顯示，HIF-1α表達高的腫瘤，具有分化差、臨床分期晚和易發生淋巴結轉移等特點。且HIF-1α和MVD的表達及VM相互之間具有正相關性，這說明缺氧可能會參與腫瘤的血管與VM的形成。缺血和缺氧是惡性腫瘤發展過程中的普遍現象，當腫瘤細胞缺氧時，HIF-1α會上調VEGF表達[12]，誘導新生血管形成，可以暫時緩解腫瘤細胞的缺血、缺氧狀態。當新生血管的血供還不能夠滿足腫瘤細胞營養需求時，這時某些具有可塑性的腫瘤細胞就會變形，形成具有VM形態的結構以獲得足夠供氧，所以具有VM結構的腫瘤細胞周圍沒有壞死。本研究結果與國內外文獻[13-16]報道一致。同時文獻[15]還報道，抑制HIF-1α的表達可以阻斷VM的形成，這說明缺氧很可能是誘導腫瘤細胞形成VM的一個重要始動因素。

CD82/KAI1基因首先發現于前列腺癌細胞，曾被認為是前列腺癌特異性的轉移抑制基因，命名為KAI1基因[17]，后來對該基因的定位及DNA全長序列測序證明，其與CD82基因完全相同，故又將其命名為CD82/KAI1基因，屬于TM4SF家族。在腫瘤中CD82/KAI1基因的異常形式表現為基因突變、等位基因缺失和表達水平的改變等，其中表達水平與腫瘤侵襲、轉移關系密切。本研究發現CD82/KAI1蛋白在腫瘤組織中的表達水平比在正常組織中明顯降低，差異具有統計學意義；并且隨著腫瘤分化越低、臨床分期越晚，其表達水平也越低，差異有統計學意義；在伴有淋巴結轉移的腫瘤中其表達水平也較沒有淋巴結轉移的腫瘤明顯降低，與文獻[18,19]報道一致。提示CD82/KAI1基因表達異常與NSCLC的發生、發展及侵襲、轉移密切相關。CD82/KAI1表達異常使CD82/KAI1正常功能減弱或喪失，從而失去抑制腫瘤轉移的功能。

表 1 NSCLC中VM、CD82/KAI1、HIF-1α和MVD的表達與臨床病理因素的關系Tab 1 Correlation of VM and CD82/KAI1 and HIF-1αand MVD expression to clinicopathologic characteristics in NSCLC

表 2 NSCLC中VM、CD82/KAI1、HIF-1α和MVD各因素之間的相互關系Tab 2 The expression of VM and CD82/KAI1 and HIF-1α and MVD, and their relationship in NSCLC

表 3 160例NSCLC患者多因素分析Tab 3 Multivariate survival analysis of 160 patients with NSCLC

本研究多因素分析顯示HIF-1α和CD82/KAI1的表達情況、VM和pTNM分期是影響NSCLC的獨立預后因素，而MVD并非NSCLC的獨立預后因素。pTNM分期作為術后治療的標準已為人們所重視，因此尋找新的可以反映腫瘤細胞生物學行為并對pTNM分期起到一定補充作用的分子標記物顯得更為重要。進一步的生存分析顯示VM、HIF-1α和MVD陽性組的5年生存率明顯低于陰性組，提示VM、HIF-1α和MVD陽性組的NSCLC患者的生存時間比較短，比其陰性組預后差，這與文獻[21,22]報道一致。CD82/KAI1陽性組與陰性組的5年生存率分別為66.7%和3.0%，差異有統計學意義，即CD82/KAI1陽性表達組的生存時間高于陰性表達組，這與其他學者研究結果相同[19-20]。

本研究中，VM和HIF-1α在對照組20例正常肺組織中均不存在，而在NSCLC中表達于部分肺癌細胞，差異明顯；并且隨著腫瘤的進展，VM、HIF-1α和MVD的陽性率增多。對CD82/KAI1蛋白與VM、HIF-1α、MVD的表達進行相關性分析，發現癌組織中隨著CD82/KAI1表達率的降低，VM、HIF-1α和MVD的陽性率明顯增多，呈負相關。提示CD82/KAI1蛋白的表達與VM、HIF-1α、MVD的陽性率可能存在一定聯系。隨著腫瘤的快速進展，腫瘤組織會發生缺血缺氧，缺氧會誘導新生血管及VM形成；而此時CD82/KAI1表達降低導致癌細胞間的粘附力減弱，移動性增強、細胞分化低[20]；而具有VM結構的腫瘤細胞與管腔僅間隔一層PAS陽性物質，此時粘附力降低的腫瘤細胞在血流的沖擊下，很容易脫離原發灶而發生淋巴結轉移甚至遠處轉移[20]。

綜上所述，CD82/KAI1基因表達降低可能是NSCLC發生侵襲、轉移的分子基礎，血管生成和血管生成擬態可能是NSCLC發生侵襲、轉移的關鍵事件。因此，CD82/KAI1、VM、HIF-1α和MVD可作為評估NSCLC轉移和預后的指標。