實時定量PCR 2-ΔΔCt法檢測非小細胞肺癌HER2基因的過表達

奉水東 譚紅專 凌宏艷 袁秀琴

HER2基因過表達能增強腫瘤的生長、惡性型變及侵襲力，且與較差的臨床預后和化學藥物耐受有關[1]，因此，正確評價HER2基因表達的狀況對于腫瘤的治療、干預、預后估計及抗腫瘤藥物的篩選等具有重要的指導意義。研究[2,3]發現非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）HER2基因突變的發生率很低，但HER2基因的過表達卻較常見，因此常通過檢測HER2基因的過表達來探討HER2基因在肺癌發生、發展中的作用。目前各研究報道的HER2基因過表達率不一致，這主要與檢測方法的選擇以及方法的敏感性有關。HER2基因表達的狀況大多采用免疫組織化學法（immunohistochemistry, IHC）來進行評價[4-6]，但該方法的變異性較大，操作過程中容易受各種主、客觀因素的影響，如判斷標準、抗體的敏感性以及不同的實驗條件等都可能產生不同的陽性率。因此，采用更為客觀的方法評價HER2基因在肺癌中的表達很有必要。

近年來出現的實時定量PCR（real-time quantitative PCR, RT-Q-PCR）技術實現了PCR從定性到定量的飛躍，它以特異性強、靈敏度高、重復性好、定量準確、速度快、全封閉反應等優點成為了分子生物學研究的一個重要工具。因此本研究嘗試采用RT-Q-PCR評價NSCLC HER2基因的表達水平，以期為肺癌臨床干預策略的制定提供依據。

1 對象與方法

1.1 對象的來源 選擇2006年6月-2007年6月在湖南省腫瘤醫院、中南大學湘雅醫院和中南大學湘雅二院三所大型醫院收治住院并通過病理組織學確診為NSCLC的所有患者作為研究對象，收集其肺癌組織和與其匹配的非腫瘤組織標本各212例，于-80oC冷凍保存。其中包括男性172例，女性40例。病理組織學類型為：腺癌46例，鱗癌126例，腺鱗癌37例，肺泡細胞癌3例。TNM分期：I期66例，II期50例，III期70例，IV期26例。

1.2 實驗方法

1.2.1 主要儀器 包括：SDS-PAGE微型電泳儀及電泳槽（BioRad公司），普通梯度PCR儀（BioRad公司），低溫高速離心機（Eppendorf公司），紫外分光光度計（Beckman公司），凝膠成像分析系統（Alpha公司），瓷研缽（民生堂大藥房），icycler iQ熒光定量PCR儀（Bio-Rad公司）。

1.2.2 主要試劑 包括：Trizol（上海invitrogen公司），焦碳酸二乙酯（DEPC）（Sigma公司），AMV逆轉錄試劑盒（美國Promega公司），瓊脂糖（美國BBI公司），HER2、β-actin引物和探針（上海生工生物工程技術服務有限公司）；熱啟動熒光PCR核心試劑盒（上海軒昊科技公司）；dNTPs、TaqDNA聚合酶、100 bp DNA Marker均購自北京天根生化科技有限公司；氯仿、乙醇、異丙醇（均為分析純）購自北京鼎國生物技術有限公司。引物序列如下：HER2（120 bp）：F: 5'-TCCTGTGTGGACCTGGATGAC-3'；R: 5'-CCAAAGACCACCCCCAAGA-3'；β-actin（207 bp）F: 5’-TCCTTCCTGGGCATGGAG-3'；R: 5'-AGGAGGAGCAATGATCTTGATCTT-3'。TaqMan探針序列如下：HER2：5'(FAM)-AGCAGAATGCCAACCACCGCAGA-(TAMRA)-3'，β-actin：5'(FAM)-CCTGTGGCATCCACGAAACTACCヰC-(TAMRA)-3'。

1.2.3 實驗方法 HER2基因和內標基因β-actin在不同的反應管中分別擴增，均為20 μL PCR反應體系：熱啟動熒光PCR核心試劑10 μL、上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL、TaqMan探針（10 μmol/L）3 μL、cDNA 2 μL、雙蒸水 4 μL。實時定量PCR擴增參數：預變性94oC、10 min；94oC變性30 s，60oC延伸1 min，延伸結束時檢測熒光信號，共40個循環。

為了驗證方法的特異性，將HER2與β-actin基因的PCR擴增產物于2%瓊脂糖凝膠中電泳。同時將β-actin和HER2基因的引物互換而探針不變進行RT-Q-PCR檢測，觀察有無熒光信號響應。為了觀察RT-Q-PCR的擴增效率，取1份cDNA標本分別進行10倍倍比稀釋作為HER2與β-actin基因擴增的模板，每個基因各5管（5個濃度），進行RT-Q-PCR并描繪cDNA對數濃度與Ct值的相關曲線，觀察曲線的斜率和相關系數，通過斜率計算擴增效率，公式為E=10-1/k-1（E為擴增效率，K為標準曲線的斜率）。

1.3 統計分析方法

1.3.1 實驗數據處理 為了便于對所檢測樣本進行比較，在RT-Q-PCR反應的指數期，首先需設定一定熒光信號的閾值，一般這個閾值是以PCR反應的前15個循環的熒光信號作為熒光本底信號。如果檢測到熒光信號超過閾值被認為是真正的信號，它可用來定義樣本的閾值循環數（threshold cycles, Ct）。每個模板的Ct值與樣品中起始模板的拷貝數的對數存在線性反比關系，起始拷貝數越多，Ct值越小。每個標本重復3次，Ct值取平均值，ΔCt值=HER2基因Ct值-β-actin基因Ct值，以β-actin為對照；ΔΔCt值=肺癌組織HER2的ΔCt值-癌旁組織HER2的ΔCt值，以癌旁組織為對照。以癌旁組織的HER2基因表達量為1，2-ΔΔCt值即為肺癌組織相對癌旁組織HER2基因表達的倍數，測定值以2-ΔΔCt≥2作為高表達的標準[7]。

1.3.2 統計分析方法 所有實驗數據使用EpiData 3.0軟件建立數據庫。運用SPSS 16.0軟件進行統計分析，肺癌組織與癌旁組織中HER2基因表達水平的差異分析采用Wilcoxon符號秩和檢驗， P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 總RNA的純度和完整性分析 所提取的總RNA經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，可見兩條清晰的28S和18S RNA條帶，5S隱約可見（圖1），且加樣孔未見亮帶。表明提取的RNA質量完好且無DNA污染。取2 μL提取的RNA稀釋500倍，用紫外分光光度計檢測其OD值，A260/A280=1.8-2.0，表明RNA純度較高，符合分析的要求。

2.2 RT-Q-PCR擴增產物鑒定 RT-Q-PCR擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下可觀察到預期大小與目的片段一致的電泳條帶（圖2）。

圖 1 RNA的1%瓊脂糖凝膠電泳圖Fig 1 The electrophoretogram of RNA in 1% concentration of agarose gel

圖 2 實時定量PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖。M：分子量標志；1，2：HER2基因擴增片斷；3：β-actin基因擴增片斷。Fig 2 The electrophoretogram of real-time quantitative PCR products in agarose gel. M: DNA marker； 1,2: Fragments of HER2 gene amplification； 3: Fragments of β-actin gene amplification.

2.3 RT-Q-PCR檢測HER2基因mRNA的動力曲線 將cDNA模板各加入不同的反應管中，為了檢驗該方法的重復性，每個基因同一濃度的cDNA設3個復孔。在icycler iQ熒光定量PCR儀上進行擴增，結果顯示同一基因的擴增動力曲線基本重疊（圖3）。從圖中可看出HER2和β-actin擴增的動力曲線都呈S型曲線的形態。

2.4 RT-Q-PCR特異性測試和擴增效率檢測 HER2與β-actin基因擴增產物電泳結果僅顯示一條與目的片段大小相符合的條帶（圖2）。將β-actin和HER2基因的引物互換，探針不變，同時進行實時熒光檢測，結果顯示，在45個循環內未檢出陽性信號，說明探針的特異性良好。

分別把10倍倍比稀釋的cDNA模板進行HER2和β-actin基因的實時定量PCR擴增，各5個濃度，每個濃度設3個復孔。計算出每個濃度HER2和β-actin基因的平均Ct值以及ΔCt值，通過ΔCt值對cDNA的對數濃度值作圖，如果所得直線斜率絕對值接近于0，說明目的基因和內標基因的擴增效率相同，就可以通過RT-Q-PCR 2-ΔΔCt方法進行相對定量。在圖4A中，直線斜率是-0.044,5，接近0，說明可以用RT-Q-PCR 2-ΔΔCt相對法進行分析數據。如果所有的PCR反應有基本一致的擴增效率，就可以用比較Ct法的相對定量策略，而無需每次PCR時做相對定量的標準曲線。分別以HER2和β-actin基因的Ct值對相應的cDNA對數濃度作圖（圖4B），HER2和β-actin基因對應的相關系數分別為0.999,9和0.997,6，斜率分別為-3.424,9和-3.405,2，擴增效率分別為96%和97%。

2.5 HER2基因在肺癌組織與癌旁組織表達的差異及在肺癌組織中的過表達率 經檢測發現，212例肺癌組織和其相應的癌旁組織HER2基因均有表達，肺癌組織HER2基因的中位數表達水平為4.67（0.21-48.74），癌旁組織HER2基因的中位數表達水平為3.17（0.28-21.26），肺癌組織高于癌旁組織，差異具有統計學意義（P＜0.01）。在212例NSCLC中，有72例肺腫瘤組織的HER2基因表達水平高于癌旁肺組織2倍或2倍以上，過表達率為34.0%（72/212）。

3 討論

HER2是EGFR家族中表達相當廣泛的受體，在許多上皮源性的腫瘤細胞中過表達[8,9]。以往肺癌HER2基因表達的研究主要基于免疫組化，使用熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization, FISH）和RT-Q-PCR的較少。FISH相對于其它方法有更高的準確性[10]，但步驟比較繁瑣和復雜。而RT-Q-PCR相對于前兩者有其獨特的優勢，因為RT-Q-PCR可以基于匹配的非腫瘤組織的背景表達水平對每一個樣本目的基因的表達水平進行比較精確的測量，有高通量處理樣本的能力和較寬的動力學范圍，能夠有效地避免交叉污染和實現操作自動化。事實上，在評價乳腺癌HER2基因表達的狀況時，RT-Q-PCR已經被提出作為FISH和IHC的替代方法[11]。

RT-Q-PCR分析可以分為相對定量和絕對定量兩類。相對定量法更加簡單、經濟，而且也更為準確和可靠，因為存在于反應體系中的干擾因素，如樣本不純、試劑不同批次等因素的影響都可以通過加入管家基因作為內標準進行校正而去除。采用實時PCR 2-ΔΔCt相對定量法比較目的基因在不同樣本中的表達差異必須滿足一定的條件，本研究結果顯示，在ΔCt與cDNA對數濃度關系曲線中，斜率為-0.044,5，接近0，說明目的基因和管家基因的擴增效率基本一致；Ct值對相應的cDNA對數濃度作圖，HER2和β-actin對應的相關系數分別為0.999,9和0.997,6，斜率分別為-3.424,9和-3.405,2，擴增效率分別為96%和97%，表明有良好的線性關系和接近100%的擴增效率。因此，本研究所采用的RT-Q-PCR 2-ΔΔCt相對定量法滿足了其運用的基本條件，表明該方法的應用是可行的，無需每次測定制作標準曲線，只需比較不同組織目的基因與內標基因的ΔCt值，即ΔΔCt值即可。

圖 3 HER2和β-actin基因實時定量PCR擴增動力曲線圖Fig 3 The dynamical curve of real-time quantitative PCR for HER2 and β-actin genes

圖 4 HER2和β-actin基因的實時定量PCR擴增效率檢測。A：HER2和β-actin基因的△Ct與cDNA對數濃度的關系曲線；B：HER2和β-actin基因的Ct與cDNA對數濃度的關系曲線。Fig 4 The amplification efficiency detection of real-time quantitative PCR for HER2 and β-actin genes. A: the curve of the relation between ΔCt and cDNA logarithmic concentration for HER2 and β-actin genes. B: the curves of the relation between Ct and cDNA logarithmic concentration for HER2 and β-actin genes.

本實驗結果顯示，肺癌組織相對于癌旁組織HER2基因的表達水平明顯上調（P＜0.01）。在212例NSCLC標本中， 72例為過表達（2-ΔΔCt≥2），過表達率為34.0%（72/212），與Brabender等[12]和Pellegrini等[4]的報道基本一致，提示RT-Q-PCR 2-ΔΔCt法用于檢測NSCLC HER2基因的表達是可行的。