同源結構域相互作用蛋白激酶2最新研究進展及其應用

賈文韞 李寶蘭 岳文濤

作者單位:101149 北京,北京市結核病胸部腫瘤研究所細胞室(賈文韞,岳文濤);101149 北京, 北京胸科醫院綜合科(李寶蘭)(通訊作者:李寶蘭,E-mail: libaolan1109@yahoo.com.cn)

同源結構域相互作用蛋白激酶2(homeodomaininteracting protein kinase -2, HIPK 2)是近二十年來發現的一種定位在細胞核內,調節多種細胞、組織和器官功能的絲氨酸/蘇氨酸激酶.HIPK 2是潛在的腫瘤抑制因子和DNA損傷相關激酶,它通過磷酸化反應作用于不同的下游靶點來激活凋亡進程.此外,HIPK 2還參與組織器官的形成、腫瘤的發生和發展.由于其作用廣泛,近年來受到廣大學者的關注.

1 HIPK 2的基本信息

上世紀90年代,Kim等[1]發現了一個由保守的蛋白激酶結構域和一個同源蛋白相互作用結構域組成的新的核蛋白激酶家族,由于該蛋白家族能夠增強同源轉錄蛋白的活性,特命名為HIPK.目前HIPK家族包括3個成員:HIPK 1、HIPK 2和HIPK 3.HIPK 2基因包含13個外顯子,大小約59X103bp,定位于7q33-7q34.HIPK 2高度保守,在小鼠定位于染色體6B.小鼠與人類之間HIPK 2氨基酸序列98%同源[2].HIPK 2在各類組織中表達各異.我們在實驗中也發現HIPK 2 mRNA在各肺癌細胞系中表達量不盡相同.

HIPK 2含1,189個氨基酸,屬于DYRK激酶家族,作為同源蛋白的一個轉錄輔助抑制物具有多個功能域:①和同源蛋白相互作用的結合域;② PEST(proline glutamic acid serine or threonine)序列,是位于細胞內、半衰期不到2 h的富含脯氨酸、谷氨酸、絲氨酸及蘇氨酸的區域,與蛋白的快速降解有關,因此哺乳動物細胞中很難獲得該蛋白的信息[3];③輔助抑制域;④位于C-端的YH序列;⑤位于N-端的蛋白激酶活化域.定位于細胞核內的蛋白質都具有的"核定位序列(nuclear localization sequence,NLS)".

HIPK 2可以作用于多種功能性蛋白質,包括轉錄調節蛋白、染色質調節蛋白、細胞內信號轉導蛋白、跨膜蛋白以及小泛素相關修飾連接酶(small ubiquitin-related modif i er, SUMO)的E2成分[4,5].因此有學者[6]認為HIPK 2是重要的調節因子.

2 HIPK 2的功能

2.1 HIPK 2對靶點的調節 當細胞受到各種損傷時,HIPK 2會與腫瘤抑制因子p53形成復合物,磷酸化p53的Ser46,進而激活p53靶基因puma、bax和noxa等[7-11].已經證實p53的Ser46在嚴重DNA損傷導致的凋亡中有重要作用[12].HIPK 2還能磷酸化小鼠p53 Ser58(Ser46的同源位點)引發凋亡[13].為了有效磷酸化p53,HIPK 2利用腫瘤抑制蛋白(promyelocytic leukemia, PML)作為輔助因子[14].HIPK 2和PML將p53整合為PML-NBs[15,16]而恢復p53活性[17-19].HIPK 2還能與乙酰轉移酶連接蛋白(CREB-binding protein, CBP)相互作用,在CBP幫助下,HIPK 2與p53定位于PML-NBs.在HIPK 2磷酸化p53 Ser46后,CBP乙酰化p53的Lys373和Lys382[20].p53 Lys373/Lys382乙酰化在誘導凋亡和細胞老化中起著至關重要的作用[11].

除了PML及其相關的NBs,Wnt/β-catenin信號通道的支架蛋白Axin[21]、PML-NB片段Sp100[22]、Sp70、Daxx[23]和p53誘導因子p53DINP1/TP53INP1[24,25]都可以與p53和HIPK 2結合,作為HIPK 2磷酸化p53 Ser46的輔助因子[26].例如:HIPK 2會以將β-catenin的Ser33和Ser37殘基磷酸化和依賴蛋白酶體將β-catenin降解的方式,減弱Wnt/β-catenin信號通路,抑制體內外細胞增殖,但是當β-cateninatitsSer33和Ser37突變為丙氨酸時,HIPK 2將不能發揮上述作用[27].

目前有發現在急性前髓細胞性白血病中HIPK 2時常與類維生素A受體-α(RARα)融合.由于DNA損傷,HIPK 2磷酸化PML的Ser8和Ser38.盡管HIPK 2介導的PML磷酸化只發生在DNA損傷反應的早期,但是具有致癌性的PML-RARα融合蛋白仍然受到強烈的遲發動力學效應,繼續磷酸化;而且DNA損傷或者HIPK 2表達可以穩定PML和PML-RARα融合蛋白.N末端磷酸化部位導致DNA損傷引發的PML泛素化,而且它是PML與HIPK 2相互作用誘導細胞死亡的必需條件[28].

另外,在幾種上皮腫瘤中增強整合素α6和整合素β4的表達能促進腫瘤發展,但是具體機制不清楚.敲除HIPK 2能激活整合素β4轉錄,進而明顯增加整合素β4依賴性促分裂原活化蛋白和AKT磷酸化.在p53表達的細胞(野生型wtp53細胞系)中保證HIPK 2水平就能抑制整合素β4的表達,缺失或者突變的p53細胞中卻不會出現這種現象.這說明HIPK 2通過p53起作用.與體外實驗相符的是表達p53的野生型人乳腺癌細胞中整合素β4過表達與HIPK 2活性受抑制有極其密切的關系.當消除HIPK 2和p53的功能后,p53家族的TAp63和TAp73能強烈激活整合素β4轉錄.總之,p53功能缺失有助于輔激酶蛋白與p53家族中TA成員結合,繼而允許整合素β4轉錄[29].

HIPK 2還表現出許多與p53無關的作用功能和方式.人類轉錄因子ZBTB4是HIPK 2的新靶點,兩蛋白可以在體外相互作用,在體內也因局部化而相互結合.HIPK 2可以磷酸化ZBTB4的幾個保守的殘基,即795、797和983位蘇氨酸.過表達HIPK 2可使ZBTB4降解,而過表達激酶缺陷型HIPK 2突變體則沒有這種作用.HIPK 2的化學活性還能減少細胞中ZBTB4的數量,反之用藥物或者RNA干擾可以增加ZBTB4水平.上述HIPK對ZBTB4負性調節都是在正常培養條件下進行的.另外,ZBTB4的降解也隨著DNA損傷而增加.Yamada等[30]發現ZBTB4可以抑制p21轉錄、對抗損傷細胞的細胞周期停滯,引導其凋亡.因此HIPK 2對p21的活化可能有兩條途徑,刺激活化劑p53,同時抑制抑制劑ZBTB4.重要的是HIPK 2在作用過程中并沒有磷酸化p53.

Rett綜合癥是一種神經系統的嚴重失常現象.甲基化的CG序列結合蛋白2(MeCP2)突變與Rett綜合癥和其它神經系統疾病有關,它通過增加各種輔阻遏物而抑制轉錄.最近發現,大腦中MeCP2發生Ser80、Ser229和Ser421磷酸化,調節MeCP2沉默活性.Bracaglia等首次鑒定出HIPK 2作為激酶可以在體內外與MeCP2結合并磷酸化其Ser80,而且HIPK 2必須與MeCP2的DNA結合才能磷酸化其Ser80,誘導凋亡.HIPK 2基因缺失小鼠的神經缺陷表明了其對正常大腦功能維持的重要作用[31].

在p53缺失的細胞內,HIPK 2一樣能夠調控DNA損傷細胞的凋亡.HIPK 2將C末端結合蛋白CtBP Ser422磷酸化,使CtBP在蛋白酶體降解.而且,在p53缺失的肝癌細胞系內,p53通過激活JNK信號通路調節轉化生長因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)介導凋亡[32].在紫外照射損傷時,JNK也能調節CtBP Ser422磷酸化及凋亡,這說明HIPK 2既能直接磷酸化CtBP,又能間接通過JNK協同取得相同的結果[32,33].

2.2 p53及其它因子對HIPK 2的調節作用 HIPK 2的功能反過來也會受到p53的調節,而且p53同時具有激活和抑制HIPK 2的能力.p53通過caspase途徑作用于HIPK 2的916和977位天冬氨酸殘基[34,35].更令人驚奇的是HIPK 2的生成過程中需要p53的靶基因caspase-6[36].因此,p53可以利用其caspase通路反向調節HIPK 2的凋亡活性.

有資料[37]顯示p53介導的E3泛素連接酶MDM2/HDM2可能是HIPK 2的負性調節因子,在DNA出現損傷時,它可以泛素化HIPK 2,并將其降解.

酵母雙雜交試驗證實WD40/SOCSbox蛋白(WSB)作為E3泛素連接酶,可以與HIPK 2相互作用.過表達WSB-1可以使其利用C末端降解HIPK 2.利用shRNA敲除內源WSB-1能增加內源HIPK 2的穩定性并使其聚集.在WSB-1中,主要是WD40重復序列和SOCS盒與HIPK 2結合并降解,而且WSB-1在體內外都能泛素化HIPK 2[38].含保守序列WD-40蛋白的人類花色素苷調節劑基因11(Han11)可以干擾HIPK 2,體外Han11可直接與HIPK 2結合,通過HIPK 2調節激酶信號系統[39].

3 HIPK 2與肺癌

p53對MDM2的負性調節非常敏感,MDM2通過自動調節通路可以明顯抑制p53活性.由于應激,p53發生翻譯后修飾,使其逃脫MDM2的控制,蓄積而激活.最近在肺癌細胞系中發現[4],在MDM2參與下HIPK 2對p53有活化作用.DNA損傷后,HIPK 2連接并磷酸化p53,使其轉錄、凋亡,克服MDM2抑制.細胞發生DNA損傷后,可以通過阻止p53出核轉運和MDM 2調節的蛋白化調節p53介導的凋亡.這就進一步闡釋了HIPK 2/p53通路促進凋亡和抑制腫瘤形成的機制.

基因敲除小鼠胚胎成纖維細胞轉錄輔抑制子羧基末端凝結蛋白CtBP可以上調包括凋亡在內的多種基因.因此,有人預言可以通過調節細胞內CTBP的水平來調節凋亡能力.如前所述,HIPK 2就是這樣一個因子,而且證實HIPK 2激活可以使CtBP Ser422磷酸化而降解.研究發現c-Jun氨基末端激酶1(c-Jun NH2-terminal kinase 1)活化也可以磷酸化CtBP Ser422并降解,使與p53無關的人肺癌細胞系凋亡.JNK1以前曾被認為與紫外線介導的凋亡有關,表達MKK7-JNK1或者紫外照射會通過蛋白酶體介導的通路減少CTBP水平 .這一作用會因為JNK1缺失而受阻.此外,使用順鉑持續激活JNK1通路產生了類似的CTBP降解現象.這一結果為p53缺失型腫瘤提供了新的化療靶點[35].

當核酸毒性藥物使DNA受損時,HIPK 2能使腫瘤抑制因子p53atSer46磷酸化,進而啟動凋亡過程.HIPK 2在某些細胞內被以蛋白酶體依賴的和泛素連接酶Siah1部分依賴的方式泛素化降解而失活[40].HIPK 2還是低氧誘導因子1α(hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)的轉錄輔抑制子,可以抑制腫瘤血管生成和對抗耐藥的產生.HIPK 2在腫瘤中由于缺氧等多種機制而擺脫調控.研究人員想通過恢復HIPK 2功能和抑制HIF-1α來研究缺氧問題,以此證實HIPK 2和p53與缺氧導致的耐藥有關. 因為增加HIF-1α表達或者以藥物抑制p53功能就會損傷HIPK 2的功能,于是作者用低氧或者鈷元素處理結腸和肺癌細胞系.鈷能抑制HIPK 2對HIF-1α啟動子的募集反應,低氧使p53靶點MDM2表達,并下調HIPK 2,當對MDM2進行RNA干擾后,恢復了用藥時的HIPK 2/p53 Ser46磷酸化反應[41].另外,雖然低氧可以不可逆的抑制HIPK 2,但是補充鋅可以重新激活缺氧抑制的HIPK 2,使得HIF-1通路受到抑制,恢復p53 Ser46凋亡活性[42]..

4 HIPK 2的初步應用

如前所述,WSB-1對泛素化和降解HIPK 2有重要作用,但是當應用阿霉素和順鉑等DNA損傷藥物時,該作用會被完全抑制.這就解釋了一些腫瘤的耐藥機制,并提供了解決問題的可能方向[38].

鑒于HIPK 2/p53 Ser46通路的重要作用,有學者分別比較了順鉑敏感和抗藥的卵巢癌細胞系2008和2008C13內藥物引發的HIPK 2/p53 Ser46凋亡通路.藥物(阿霉素和順鉑)不同,兩細胞系內HIPK 2的表達也不同.在耐藥細胞系內沒檢測到p53 Ser46凋亡通路.盡管2008C13細胞系耐受順鉑,但是對阿霉素介導的HIPK 2/p53 Ser46凋亡通路很敏感,而且敲除HIPK 2后,上述作用就會受到抑制.添加外源HIPK 2和轉入p53 Ser46的靶基因AIP1能誘導耐鉑細胞的凋亡.這些結果表明鉑類耐藥存在不同的藥物激活通路調節HIPK 2和HIPK 2/p53 Ser46,外源性的HIPK 2可能成為治療耐藥野生型p53卵巢癌的新療法[43].

很長時間以來人們也在尋找無遺傳毒性的特異性p53復活劑.MDM2對抗劑Nutlin-3和RITA是兩種能夠誘導有絲分裂停滯、臨床學者所期盼的具有凋亡效應的藥物.在經Nutlin-3處理的細胞系內,隨著p53復活,MDM2將p53凋亡前活化劑HIPK 2降解,但是在RITA處理的細胞系內,短暫降低MDM2水平又會將HIPK 2激活.這表明MDM2對HIPK 2的調節對于決定細胞是有絲分裂停滯還是凋亡有很大作用,此外提示了欲利用MDM2對抗劑復活p53功能,可以將目光投在MDM2的靶點,而不是僅僅考慮p53本身[44].

基于鈷和低氧對HIPK 2的調節作用機理,在低氧環境細胞培養基中添加鋅能增強

HIPK 2蛋白的穩定性和在細胞核內的聚集,使HIPK 2重新與HIF-1α啟動子結合,抑制MDR1、Bc12和VEGF基因轉錄,激活p53凋亡對藥物的反應.聯合應用鋅和ADR可以通過抑制HIF-1α通路和上調p53凋亡靶基因而明顯抑制體內腫瘤生長[41,42].這對抗腫瘤新藥的研發或者原有藥品的改造和利用具有很好的提示作用.

由于使用阿霉素化療所致的缺氧腫瘤細胞內,p53 Ser46磷酸化受損,腫瘤產生耐藥,但是,應用蛋白酶體抑制劑能恢復缺氧肝細胞內HIPK 2的表達、p53 Ser46磷酸化和caspase活性.因此,蛋白酶體抑制劑可作為潛在方法,使缺氧腫瘤細胞對治療仍然敏感[40].

5 問題與展望

盡管目前人們對HIPK 2調節機制和信號通路有了更加深入的了解,但是仍有許多問題有待解決,如由于HIPK 2廣泛的降調作用,人們普遍認為HIPK 2是一個腫瘤抑制基因,而且HIPK 2在乳癌、甲狀腺癌以及血液學疾病中表達下調,但是在結腸癌和宮頸癌中表達比良性病變和正常組織中高[45].這些差別的原因何在?低表達的原因有是否相同?是基于機制的不同,還是由于技術層面原因?在這一過程中是否出現了HIPK 2的突變,突變后作用如何?能否為相關腫瘤提供化學或基因治療的現希望?這些問題都需要廣大學者進一步深入研究.