Man5GlcNAc2哺乳動物甘露糖型糖蛋白的畢赤酵母表達系統構建

楊曉鵬，劉波，宋淼,2，鞏新，唱韶紅，薛奎晶,2，吳軍

1 軍事醫學科學院生物工程研究所，北京 100071

2 沈陽藥科大學生命科學與生物制藥學院，沈陽 110016

近年來，藥用蛋白市場的需求越來越大，在這些蛋白中糖蛋白占絕大多數，例如各種治療性抗體、細胞因子等。糖蛋白是糖基與蛋白共價相連構成的結合蛋白，糖蛋白的糖基與蛋白的功能、穩定性均有著密切的聯系[1]。糖蛋白根據糖基和蛋白質的連接方式不同，可分為2大類，即O-連接和N-連接糖蛋白。其中，對N-連接糖蛋白的糖基化修飾研究得比較透徹，其修飾序列極端保守，即在Asn-X-Thr/Ser (X為除Pro外的任意氨基酸) 的Asn殘基上。

目前重組糖蛋白藥物的生產主要是哺乳動物細胞表達系統。但該系統培養成本高、生產周期長[2]。因此，利用酵母細胞來替代哺乳動物細胞生產重組蛋白藥物已日益受到人們的重視。酵母表達系統具有原核細胞系統生長速度快、便于基因操作和可工業化大規模培養等優點，同時又具有真核細胞大部分的翻譯后加工修飾能力，因而廣泛用于各種蛋白的表達[3]。巴斯德畢赤酵母屬于甲基營養型酵母，是第2代酵母表達系統的代表，作為成熟的表達系統，它還具有表達量高、較穩定、可分泌、易純化及成本低等優點[4-7]，但目前主要應用于非糖蛋白的生產，這是因為當畢赤酵母表達系統用于多數重組糖蛋白藥物的生產時，還存在一些問題，其中最關鍵的是畢赤酵母對糖蛋白的過度糖基化修飾，即形成不同于哺乳動物細胞的雜合型或復雜型糖基結構，而是高甘露糖型糖基或過度糖基化結構[8-9]，這種高甘露糖型糖基結構的糖蛋白在人體中容易被清除、半衰期較短、且易產生較高的免疫原性；同時對某些蛋白過度的糖基化修飾也會造成產物的分子量不均一，或者一些活性位點的遮蔽[10]，影響其功能和活性。這些都限制了畢赤酵母在糖蛋白類藥物生產方面的應用。

酵母和哺乳動物N-糖基化修飾途徑在內質網中的起始步驟都是相同的，在內質網中，在寡糖轉移酶作用下，Glc3Man9GlcNAc2被連接到新生肽鏈的專一序列上，即Asn-X-Thr/Ser的Asn殘基上，隨后在葡萄糖苷酶Ⅰ、Ⅱ和內質網甘露糖苷酶 I (MnsI)的作用下，蛋白的糖基最終被加工成 Man8GlcNAc2糖基，并轉運至高爾基體。在高爾基體內，酵母和哺乳動物糖基修飾過程明顯不同，在酵母高爾基體中，由于存在一個關鍵起始酶 α-1,6-甘露糖轉移酶(Och1p)，Man8GlcNAc2糖基在它的作用下接受第一個 α-1,6-甘露糖，形成 Man9GlcNAc2糖基，該糖基是 α-1,2、α-1,3甘露糖轉移酶及一些磷酸甘露糖轉移酶的底物，在這些甘露糖轉移酶的作用下，蛋白的糖基可以被加至數十至上百個甘露糖，形成高甘露糖，發生過度糖基化修飾[10]；而在哺乳動物高爾基體內，蛋白的糖基在 α-1,2甘露糖苷酶 I (MDSI)的作用下，Man8GlcNAc2糖基會被剪切去除 3個α-1,2連接的甘露糖，而形成Man5GlcNAc2糖基，這一糖基是哺乳動物細胞合成雜合型和復雜型糖基的前體，也是哺乳動物表達的甘露糖型糖蛋白的主要糖型，如牛核糖核酸酶B (Ribonuclease B)。而這種糖基在酵母中并不存在，所以這一結構也是酵母和哺乳動物N-糖基化修飾過程的“分界線”。

我們前期已經敲除了 Och1這一形成高甘露糖型糖基結構的關鍵酶基因，獲得了過度糖基化缺失的畢赤酵母菌株GJK01 (ura3、och1)[11]。本研究擬通過選擇不同物種來源MDSI及其定位信號，并實現其在GJK01 (ura3、och1) 中的融合表達，以獲得從酵母糖基向哺乳動物糖基改造的第一個關鍵糖型，即Man5GlcNAc2結構。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒和菌株

α-1,6-甘露糖轉移酶 (Och1p) 基因缺陷的畢赤酵母 GJK01 (ura3、och1) 菌株由本室構建。HSA/GM-CSF表達載體 pHIL-D2/HSA/GM-CSF、PGE1203-URA3 均由本室構建保存[11]。載體pPICZαA、pIB2、畢赤酵母GS115均購自Invitrogen公司。HepG2細胞由本室保存。

1.1.2 試劑和儀器

培養基和試劑：酵母抽提物、蛋白胨均為Oxoid公司產品；無氨基酸酵母氮源 (Yeast nitrogen base without amino acids，YNB) 為Difco公司產品；所用限制性內切酶、T4 DNA連接酶和去磷酸化酶(CIAP) 均為大連寶生物工程有限公司產品；牛核糖核酸酶B (RNase B)、氫化硼氰化鈉 (NaBH3CN) 均為Sigma產品；Sephadex-G10 柱色譜填料 (AB)；DNA 3100 測序儀 (ABI)；8-氨基芘基-1,3,6-三磺酸(8-aminopyrene-1,3,6-trisulfonate，APTS) (Molecular probes)；碳黑柱 (Alltech associates)。

1.2 α-1,2-甘露糖苷酶 (MDSI) 表達載體的構建

1.2.1 PGE-URA3-GAP1載體構建

GAP啟動子基因的獲取：以pGAP01和pGAP02為引物，以畢赤酵母表達載體pIB2為模板，PCR擴增500 bp GAP啟動子基因片段；CY CTT終止子基因的獲取：以pCYCTT01和pCYCTT02為引物，以畢赤酵母表達載體 pPICZαA為模板，PCR擴增300 bp的CYCTT終止子基因片段；然后通過引物pGAP01和pCYCTT02，利用PCR方法融合GAP和CYCTT，獲得GAP表達盒，片段大小約800 bp。利用Kpn Ⅰ/XbaⅠ酶切該片段，并與經過同樣酶切的pGE1203-URA3進行連接，獲得含GAP表達盒的載體 pGEURA3-GAP。利用一對互補配對的寡核苷酸引物1203MSC5、1203MSC3，退火形成雙鏈，構建至pGEURA3-GAP載體中，獲得含有多克隆位點Ssp I-Sse838 I-Swa I的載體，命名為 pGEURA3-GAP1載體。

1.2.2 載體PGE-URA3-GAP1-signal-MDSI的構建

定位信號的克隆：以釀酒酵母基因組為模板，以pMnsI5、pMnsI3為引物，PCR擴增90 bp的MnsI定位信號，以pSCsec12-5、pSCsec12-3為引物，PCR擴增300 bp 的Sec12定位信號；以乳酸克魯維酵母基因組為模板，以pKLsec12-5、pKLsec12-3為引物，PCR擴增300 bp的Sec12定位信號。將擴增得到的3種定位信號基因片段分別用Sse8387Ⅰ/SspⅠ酶切，構建至同樣酶切的pGE-URA3-GAP1載體中，獲得3種pGE-URA3-GAP1-signal載體。

MDSI基因的克隆：從人的肝癌細胞HepG2中提取總RNA，以pHmdsi(Δ185)、pHMDSI3為引物，RT-PCR擴增1 800 bp人源的編碼缺失N端185個氨基酸但包含完整C端催化區的MDSI基因片段，記為 HMDSI(Δ185)；從植物擬南芥葉片中提取總RNA，以 pATMDSI5(Δ48)、pATMDSI3為引物，RT-PCR擴增1 700 bp擬南芥的編碼缺失N端48個氨基酸但包括完整C端催化區的MDSI基因片段，記為ATMDSI(Δ48)。利用Sse8387Ⅰ/SwaⅠ酶切位點將2種基因片段分別構建至3種pGE-URA3-GAP1-signal載體中，獲得 6種載體 PGE-URA3-GAP1-signal-MDSI。

1.2.3 表達載體PGE-URA3-PNOI-GAP-signal-MDSI的構建

為了實現MDSI表達載體在酵母基因組中的定點整合，本研究選取了磷酸甘露糖轉移酶PNO1基因開放讀碼框ORF上游同源序列作為整合位點。因此，以畢赤酵母GS115基因組為模板，以PNOI5-5、Pno為引物，PCR擴增PNO1基因ORF上游序列，片段大小為1 000 bp左右，電泳回收，然后，再以回收產物與PNOI3-3為引物，以畢赤酵母GS115基因組為模板，PCR擴增2 000 bp左右基因片段，電泳回收，回收產物利用 KpnⅠ/XbaⅠ酶切位點克隆至pGE-URA3-GAP載體中，獲得pGE-URA3-PNOI載體；NotⅠ酶切 6個基因載體 PGE-URA3-GAP-signal-MDSI，將獲得的帶有MDSI基因的表達盒克隆到限制性內切酶 NotⅠ酶切并 CIAP去磷酸化的pGE-URA3-PNOI載體中，獲得表達載體 PGEURA3-PNOI-GAP1-signal-MDSI。

表1 α-1,2-甘露糖苷酶 (MDSI) 表達載體的構建引物Table 1 Primer used for constructing α-1,2-mannosidase I (MDSI) expression plasmid

1.3 HSA/GM-CSF (His6-tag) 在過度糖基化缺陷菌GJK01 (ura3、och1) 中的表達及鑒定

制備GJK01 (ura3、och1) 的電轉化感受態細胞，將 pHIL-D2/HSA/GM-CSF(His6-tag) 以限制性內切酶NotⅠ線性化后電轉入感受態細胞中，將電擊后的菌液涂布于含有尿嘧啶和精氨酸的 MD 培養基(YNB 1.34%，生物素4×10?5%，葡萄糖2%，瓊脂1.5%，精氨酸100 μg/mL，尿嘧啶 100 μg/mL) 上。5~8 d后，隨機挑取克隆接種到2 mL YPD培養基中，25 ℃培養48 h后，以5%的接種量接種到BMGY培養基中，24 h后加入0.5%甲醇進行誘導表達，每12 h補加1次甲醇，誘導72 h后離心取上清，上清用于融合蛋白的表達分析，篩選HSA/GM-CSF(His6-tag)在缺陷菌GJK01 (ura3、och1) 中的表達株。

1.4 MDSI在GJK01(ura3、och1、pHIL-D2/HSA/ GM-CSF(His6-tag) 中表達及鑒定

制備HSA/GM-CSF(His6-tag) 在GJK01 (ura3、och1) 中的表達株的感受態細胞，將 6種 PGEURA3-PNOI-GAP1-signal-MDSI分別以位于 PNOI基因 ORF上游手臂上的限制性內切酶 BamHⅠ酶切，線性化后分別電轉入感受態細胞中，將電擊后的菌液涂布于含有精氨酸的 MD培養基 (YNB 1.34%，生物素4×10?5%，葡萄糖2%，瓊脂1.5%，精氨酸 100 μg/mL) 上。5~8 d后，對長出的URA3+菌進行基因組鑒定，鑒定引物為MDSI釣取引物。將鑒定得到的MDSI轉入的陽性菌接種到2 mL YPD培養基中，25 ℃培養48 h后，以5%的接種量接種到BMGY培養基中，24 h后加入0.5%甲醇進行誘導表達，每 12 h補加一次甲醇，誘導72 h后離心取上清，上清備用。

1.5 HSA/GM-CSF(His6-tag) 的純化

收集培養上清，利用鎳親和層析方法純化末端帶有6個His標簽的報告蛋白HSA/GM-CSF。流動相為20 mmol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，pH 7.5，洗脫液另含0.5 mol/L咪唑。在280 nm處紫外吸收峰值收集純化產物，10%的SDS-PAGE鑒定表達產物。

1.6 HSA/GM-CSF(His6-tag) 的糖基分析

1.6.1 HSA/GM-CSF(His6-tag) 糖基的釋放

蛋白在0.5% SDS和1% β-巰基乙醇變性緩沖液中100 ℃變性10 min，然后在含有50 mmol/L磷酸鈉 (pH 7.5)、1% NP-40、N-糖苷酶F (PNGase F)的溶液中37 ℃酶切16 h，使HSA/GM-CSF(His6-tag)釋放糖基。

1.6.2 HSA/GM-CSF(His6-tag)糖基的純化

用80%乙腈、0.1%三氟醋酸活化碳黑柱，20%乙腈、0.05%三氟醋酸洗脫，所得糖鏈真空冷凍抽干備用。

1.6.3 APTS標記糖鏈

取糖鏈樣品，加0.02 mol/L的APTS溶液1 μL[溶于1.2 mol/L檸檬酸]，1 mol/L 的NaBH3CN溶液1 μL (溶于DMSO)。混勻，封管，置37 ℃水浴反應18 h。

1.6.4 APTS標記糖鏈Sephadex G10純化

據文獻[12]報道該方法簡單，可除去約 90%的單體 APTS，同時能保留約 70%以上的標記物復合物。樣品經G10兩次純化后真空抽干。

1.6.5 3100 DNA測序儀分析APTS標記糖鏈[17]

5 μL純水溶解G10純化且冷凍抽干的APTS標記糖鏈。最終待測樣品中含1 μL樣品，8 μL去離子甲酰胺和1 μL ROX修飾內標混合物，其中ROX內標混合物是指由羅丹明修飾的6-、30-寡核苷酸 (由5′-TAC-3′重復序列組成，由 Invitrogen公司 PAGE純化得到)。上樣后利用標準的 36 cm 毛細管及POP-6膠 (ABI) 分離，并利用GeneScan 3.7軟件進行數據分析。

2 結果

2.1 HSA/GM-CSF(His6-tag) 在P. pastoris GJK01 (ura3、och1) 中表達

為了分析外源的MDSI在GJK01 (ura3、och1)中的活性，本研究以HSA/GM-CSF(His6-tag) 作為報告蛋白。為此，必須獲得HSA/GM-CSF(His6-tag) 在GJK01 (ura3、och1) 中的表達菌株。將表達質粒pHIL-D2/HSA/GM-CSF(His6-tag) 轉入畢赤酵母GJK01 (ura3、och1) 后，隨機挑取克隆，接種至BMGY進行誘導表達，取培養上清進行SDS-PAGE分析，1、2、4、5、7號克隆在分子量接近97 kDa處出現一條蛋白條帶 (圖 1)，而非糖基化的HSA/GM-CSF(His6-tag) 分子量為85 kDa，提示該條帶為糖基化的HSA/GM-CSF(His6-tag)。

圖1 HSA-GM/CSF(His6-tag) 在 P. pastoris GJK01 (ura3、och1) 中表達的SDS-PAGE圖譜Fig. 1 The SDS-PAGE for identification of HSA/GM-CSF expressed in P. pastoris GJK01 (ura3, och1). M: molecular weight marker; 1, 2, 4, 5, 7: positive transformants; 3, 6, 8, 9: negative transformants.

2.2 α-1,2-甘露糖苷酶 (MDSI) 表達載體的構建及其轉化 GJK01 (ura3、och1、pHIL-D2/HSA/ GM-CSF(His6-tag) 基因組鑒定

構建的 α-1,2-甘露糖苷酶 (MDSI) 表達載體(圖2)，包含PNOI基因ORF上下游各1 000 bp的同源臂、GAP啟動子、目的基因及其定位信號、CYCTT終止子。其中，兩種不同來源的 MDSI基因：人源的編碼缺失N端185個氨基酸但包含完整C端催化區的 MDSI基因[HMDSI(Δ185)]和擬南芥的編碼缺失N端48個氨基酸但包含完整C端催化區的MDSI基因[ATMDSI(Δ48)]；3種不同的定位信號：釀酒酵母 MnsI (ScMnsI) 的內質網定位信號、釀酒酵母Sec12 (Scsec12) 的內質網定位信號以及乳酸克魯維酵母Sec12 (KLSec12) 的內質網定位信號，分別組合，構成6種表達載體 (表2)。

圖2 PGE-GAP-URA3-PNOI-signal-MDSI的構建Fig. 2 Construction of the plasmid PGE-GAP-URA3-PNOI-signal-MDSI.

表2 MDSI表達載體Table 2 MDSI expression plasmid

定位信號擴增的片段，瓊脂糖核酸電泳如圖3A所示，在90 bp左右、300 bp左右有特異的擴增產物片段，分別與ScMnsI、Scsec12、KLSec12的定位信號大小一致；MDSI基因克隆的片段，瓊脂糖核酸電泳如圖3B、圖3C所示，在1 800 bp左右、1 700 bp左右有特異的擴增片段，分別與 HMDSI (Δ185)、ATMDSI(Δ48)大小一致。最終獲得的表達載體PGE-URA3-PNOI-GAP1-signal-MDSI經Not I酶切分析，發現有約2.5~3.0 kb的基因表達盒片段與理論值一致 (圖 4)。并且經過測序分析顯示表達載體 PGE-URA3-PNOI-GAP1-signal-MDSI構建成功。

將3種定位信號 (ScMnsI的定位信號、Scsec12的定位信號、KLSec12的定位信號) 與 2種來源的MDSI (人源的及擬南芥來源) 表達載體電轉化GJK01(ura3、och1、pHIL-D2/HSA/GM-CSF(His6-tag)菌，對轉化菌基因組進行PCR鑒定，篩選MDSI基因整合到酵母染色體上的重組菌，1 800 bp左右的條帶與MDSI大小一致 (圖5)。

圖3 定位信號及MDSI基因PCR擴增分析Fig. 3 PCR analysis of signal and MDSI. M: DL2000 DNA marker. (A) 1: ScmnsI; 2: Scsec12; 3: KLsec12. (B) HMDSI(Δ185). (C) ATMDSI(Δ48).

圖4 PGE-GAP-URA3-PNOI-signal-MDSI載體質粒的Not I酶切圖譜Fig. 4 Characterization of PGE-GAP-URA3-PNOI-signal-MDSI digestion by Not I. M:15 kb DNA marker; 1: Scsec12-ATMDSI(Δ48); 2: KLsec12-ATMDSI(Δ48); 3: Scsec12-HMDSI(Δ185); 4: KLsec12-HMDSI(Δ185); 5: ScMnsI-ATMDSI (Δ48); 6: ScMnsI-HMDSI(Δ185).

圖5 MDSI轉化GJK01 (ura3、och1、pHIL-D2/HSA/ GM-CSF(His6-tag) 的PCR鑒定Fig. 5 PCR identification of MDSI transformed in GJK01(ura3, och1, pHIL-D2/HSA/GM-CSF(His6-tag). 1?4: GJK01(ura3, och1, pHIL-D2/HSA/GM-CSF(His6-tag) transformed with MDSI; 5: positive control; M: 2000 plus DNA marker.

2.3 HSA/GM-CSF(His6-tag) 糖鏈的制備與分析

利用PNGaseF酶對MDSI轉化GJK01/ (ura3、och1、pHIL-D2/HSA/GM-CSF(His6-tag)) 基因組鑒定正確的克隆中表達的報告蛋白 HSA/GM-CSF (His6-tag) 進行酶切，利用 SDS-PGAE對酶切的報告蛋白分析，發現HSA/GM-CSF的糖基經PNGaseF酶切后，分子量減小，說明其N-糖鏈被PNGaseF酶切除 (圖6)。

圖6 PNGaseF酶切報告蛋白 HSA/GM-CSF (His6-tag)的SDS-PAGE圖譜Fig. 6 The SDS-PAGE for characterization of HSA/GM-CSF digested by PNGaseF. 1, 3: HSA/GM-CSF expressed in GJK01 (ura3, och1, ScmnsI, ATMDSI, pHIL-D2/HSA/GM-CSF) digestion by PNGaseF; 2, 4: HSA/GM-CSF expressed in GJK01 (ura3, och1, ScmnsI, ATMDSI, pHIL-D2/HSA/GM-CSF); M: molecular weight marker.

PNGaseF酶切報告蛋白HSA/GM-CSF(His6-tag)后，樣品經碳黑柱純化獲得糖鏈，APTS標記糖鏈。由于單體 APTS的存在會影響糖鏈分析，所以再用Sephadex G10柱純化標記糖鏈，以去除單體APTS。然后利用3100 DNA測序儀分析APTS標記、純化的報告蛋白糖鏈，并利用GeneScan 3.7軟件進行數據分析，分析結果如圖7所示。

從圖 7A 中可以看出，α-1,6-甘露糖轉移酶(Och1p)基因缺陷的畢赤酵母GJK01 (ura3、och1) 表達的報告蛋白 HSA/GM-CSF(His6-tag)的糖基是Man12GlcNAc2~Man16GlcNAc2高甘露糖型糖基，其中Man14GlcNAc2、Man15GlcNAc2占絕大部分。而將釀酒酵母 MnsI基因內質網定位信號與編碼擬南芥MDSI(Δ48)基因進行融合，并將這一融合基因整合到GJK01基因組誘導表達后，糖基分析發現擬南芥MDSI能在酵母GJK01 (ura3、och1) 宿主菌中發揮了較好的生物活性，能夠將酵母GJK01中表達的報告蛋白的糖基Man12GlcNAc2~Man16GlcNAc2絕大部分剪切成 Man5GlcNAc2~Man9GlcNAc2結構 (圖7B)，這與哺乳動物來源的牛核糖核酸酶 B的Man5GlcNAc2~Man9GlcNAc2甘露糖型糖基一致 (圖7C)。通過本研究，我們利用釀酒酵母MnsI內質網定位信號與外源擬南芥 MDSI(Δ48)基因的融合表達，在GJK01 (ura3、och1) 基礎上，構建了具有合成Man5GlcNAc2哺乳動物甘露糖型糖蛋白能力的畢赤酵母表達系統。這為在酵母體內合成類似于哺乳動物雜合型或復雜型糖基奠定了基礎。

3 討論

酵母糖基工程改造是在酵母中模擬哺乳動物的糖基修飾過程，即阻斷酵母形成高甘露糖型糖基，引入外源的參與糖基修飾的酶基因，并將其定位在適當位置，使其發揮活性對糖基進行修飾，從而獲得類似于哺乳動物雜合型或復雜型糖基的過程。哺乳動物中的糖苷酶或糖基轉移酶對糖基修飾是逐個順序完成的。Man5GlcNAc2是雜合型糖基修飾酶N-乙酰葡萄糖胺轉移酶 (GnTI) 的底物，在GnTI的作用下，Man5GlcNAc2上添加一個N-乙酰葡萄糖胺，形成 GlcNAcMan5GlcNAc2雜合型糖基。因而獲得Man5GlcNAc2糖基是酵母糖基化改造中的關鍵一步，沒有Man5GlcNAc2結構，GnTI就很難發揮作用進而會影響到后續酶的進一步加工。酵母糖基工程改造是一個復雜的系統工程，這其中涉及到諸多因素。

圖7 DSA-FACE分析報告蛋白HSA/GM-CSF(His6-tag)的N-糖基結構Fig. 7 Analysis of N-Glycan on HSA/GM-CSF(His6-tag) by DSA-FACE. (A) N-Glycan of GJK01(ura3, och1, pHIL-D2/HSA/GM-CSF(His6-tag)). (B) N-Glycan of GJK01(ura3, ochI, ScmnsI-ATmdsI pHIL-D2/HSA/GM-CSF(His6-tag)). (C) N-Glycan of RNaseB M5?M9: Man5GlcNAc2?Man9GlcNAc2; M12?M16: Man12GlcNAc2?Man16GlcNAc2.

例如要實現外源基因的高效表達，需解決以下3個方面的問題。第一，基因來源的選擇，作為異源表達必須考慮外源基因在酵母中的活性問題，即酵母內環境、pH值、最適溫度等等。我們優先選擇了哺乳動物自身來源的基因以獲得哺乳動物的糖基結構，如本研究中的 MDSI基因。但由于人體溫度在37 ℃左右，與酵母生長溫度25 ℃~30 ℃存在差異，因此又選擇了植物來源的基因，其生存環境溫度范圍很廣，包含了酵母生長溫度。參與糖基化修飾的酶都是II型膜蛋白 (如MDSI)，II型膜蛋白的共同特點是，具有N端的氨基端細胞質尾、穿膜錨定區、莖區以及C端的催化區[13]。本研究中我們保留了不同長度的莖區和完整的C端催化區。其次，外源基因的準確定位問題。糖蛋白的糖基是蛋白經過內質網，內側、中間和外側高爾基體過程中逐個順序添加上去的，因此，模擬哺乳動物的糖基修飾過程，將酶定位在準確位置是必要的。為了將MDSI定位于糖基化修飾的初始環境中，即內質網或內側高爾基體，本研究選擇釀酒酵母MnsI、Sec12的定位信號和乳酸克魯維酵母Sec12的定位信號。第三，啟動子問題，我們選擇了GAP啟動子。一般用于畢赤酵母表達的醇氧化酶 (AOX) 啟動子屬于強啟動子，它需要甲醇誘導，存在一定的毒性隱患，不便于操作；GAP啟動子不需要甲醇誘導，是一種中等強度的組成型啟動子，是一種成熟的用于酵母表達的啟動子，例如人殼多糖酶基因在GAP調控下連續表達超過1個月，表達量穩定在300 mg/L[14]。同時，GAP啟動子在AOX啟動報告蛋白 (HSA/GM-CSF)之前，就啟動MDSI基因的表達，使得MDSI能更好地修飾隨后表達的報告蛋白。

本室在構建酵母缺陷菌時，利用了URA3作為營養缺陷型篩選標記，URA3是一種常用的篩選標記，可以用來進行正負篩選。缺陷菌GJK01為URA3缺陷型[11]，本研究構建的表達載體以URA3為篩選標記，當MDSI表達載體被轉入工程菌GJK01中時，在目的基因 MDSI被整合至基因組的同時，URA3也被整合至基因組，重組酵母菌可以在無尿嘧啶的培養基上生長，得到URA3+MDSI菌株；進一步可以利用5-氟乳清酸 (5-FOA) 使URA3+菌株發生第2次重組，即URA3基因重新被剔除出基因組，從而再次獲得URA3的缺陷菌株，該篩選標記將運用于下一次基因的敲除。如本實驗前期利用URA3基因已經成功敲除了畢赤酵母的 Och1p[11]和乳酸克魯維酵母的Och1p和Mnn1p (α-1,3-甘露糖轉移酶)[15]。

HSA/GM-CSF(His6-tag) 是本實驗室構建的HSA與GM-CSF的融合蛋白，GM-CSF即粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子，由127個氨基酸組成，有2個N-糖基化位點 (Asn27、Asn37)，天然的GM-CSF約有 34%的糖基化[16]。為了對糖基進行有效分析，本研究采用了基于 DNA測序儀熒光輔助糖電泳(DNA sequencer assisted FACE，DSA-FACE)[14]的方法，現在用于糖基分析的方法大都是熒光輔助糖電泳 (FACE)、質譜 (MS)、核磁共振 (NMR)，這些方法需要大量的樣品，而且很難做到高通量。DSA-FACE是借助于 DNA測序儀的一種新型的熒光毛細管電泳方法，在常規的FACE的基礎上建立起來的一種高靈敏度的糖分析方法。它用毛細管電泳代替了傳統的PAGE膠，用熒光檢測器代替了紫外燈下的熒光觀察，從而在分離能力、靈敏度上都有了很大提高。DSA-FACE方法借助DNA測序儀，如ABI 3100，可以實現了96個樣品的同步分析，因而可以滿足糖工程和糖組學高流通量篩選的要求。

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