多藥耐藥基因多態性與乳腺癌化療關系的研究進展

唐金海

腫瘤的多藥耐藥(multidrug resistant，MDR)是指腫瘤細胞在接觸了一種抗腫瘤藥物并出現抗藥性的同時，對其他結構不同、作用部位不同的藥物也產生交叉耐藥的現象，是導致腫瘤化療失敗的最主要原因。MDR可有2種不同的表型，一種是對第1次治療即產生耐藥，稱天然耐藥(natural resistance);另一種是在治療過程中產生耐藥，稱獲得性耐藥(acquired resistance)。在乳腺癌中通常以后者更為常見。腫瘤多藥耐藥的機制十分復雜，目前還未完全闡明，可能涉及細胞內藥物濃度降低、藥物靶分子改變及代謝解毒、細胞DNA損傷修復和抗凋亡功能增強等多種機理，但最被臨床認可的、研究也較為深入的是多藥耐藥基因MDR1及其編碼產物P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)的作用。為此，本文就近年來有關MDR1遺傳多態及其表達對乳腺癌化療和預后的影響以及MDR1介導耐藥的逆轉等作一綜述。

1 MDR1及其編碼蛋白

人類多藥耐藥基因MDR1定位于染色體7q21.1，含有 28 個外顯子，全長 4.5 kb，編碼 1 280個氨基酸，分子量約為170 ku。人類基因組中包含MDR1和MDR2兩個MDR基因，但只有MDR1介導多藥耐藥。MDR1編碼產物P-糖蛋白是首個被發現的ATP結合盒(ATP binding cassette，ABC)膜轉運蛋白超家族中的成員，在人類藥物轉運和處置中所起的作用也最重要，有研究表明P-gp可能與乳腺癌的獲得性耐藥有關;其可將細胞內底物包括多種抗癌藥物泵出胞外，使細胞內藥物積聚濃度下降，從而產生多藥耐藥［1］。另有研究顯示MDR細胞株具有凋亡抗性，P-gp能延緩凋亡“瀑布”的出現以協同MDR;這主要是因為P-gp除了作為藥物外排泵外，還能通過抑制Caspase-3和Caspase-8的激活，阻斷大多數抗癌藥物誘導細胞凋亡的核心通路“Caspase依賴性細胞凋亡”。

現已明確MDR1基因突變引起的單核苷酸多態性(SNP)可以改變P-gp的表達和功能，而P-gp在腫瘤細胞表面的過表達被認為是介導MDR的重要基礎。因此有研究者提出，MDR1/P-gp的功能和關系的研究必將有助于臨床腫瘤化療反應及其預后的預告和監測［2］。

2 MDR1多態性及其種族間差異

同種疾病相同劑量的藥物可以在人群或個體間產生異質性很大的療效及毒副反應，遺傳因素在其中有重要的決定作用。迄今為止，在MDR1基因中共發現50多個遺傳多態性，其中19個位于外顯子區域，8個位于內含子區域，11個位點SNP沒有引起氨基酸改變為非同義突變。在這些突變位點中，第12外顯子C1236T、第21外顯子G2677T/A和第26外顯子C3435T被發現具有重要的功能意義。G2677T/A多態可引起氨基酸被置換(Ala893Ser)，導致P-gp蛋白結構發生變化;C3435T和C1236T多態也位于編碼區，雖不引起氨基酸改變，但與蛋白折疊或功能的改變相關［3］。

近年來的研究已證實MDR1基因多態分布存在明顯的種族差異，對其研究有助于解釋不同群體對藥物代謝和效應差異的遺傳本質，同時也可為臨床針對人群或個體患者的藥物配給及其劑量選擇提供重要信息。梁劍寧等［4］研究漢族人 MDR1 C3435T多態分布，發現漢族人的突變頻率為34.7%，高于非洲人(16%)，低于歐洲高加索人(48%)，與日本人和菲律賓人接近(39%)，說明中國漢族人MDR1基因的多態分布具有自己的特點。賴泳等［5］對中國143名佤族、138名白族和257名藏族健康個體進行MDR1 C3435T基因分型，結果顯示三族之間基因型和等位基因頻率均無差異;C3435T等位基因T在佤族、白族和藏族的頻率分別為46.2%、44.9% 和 45.9%，與非洲裔美國人比較有明顯差異，而佤族和藏族與漢族比較也有差異。另有文獻報道C1236T及G2677T/A在非洲和美洲人群中表達較高，C1236T在高加索和日本人中的發生率分別為 34.4%和 14.6%，有顯著差異［6］。

MDR1最常見的單體型是由 C3435T與G2677T/A和/或C1236T組成，三者之間緊密的連鎖不均衡性已在多個研究中得到證實。由于C3435T的變異頻率隨著種族不同而變化，因而攜帶該SNP的單體型也存在著相似的種族分布變化:非洲人以野生C-G-C等位基因占優勢(C-G-C約70%，T-T-T約6.5%)，高加索人野生C-G-C和突變T-T-T一致(均40%)，而在印度人中，突變T-T-T相對占優勢(T-T-T 約35%，C-G-C 約20%)［1］。

MDR1基因多態的這種種族分布差異可明顯影響藥物的處置。如Min等［7］報道不同種族的人群有不同的環孢素(P-gp轉運底物)生物利用率，白種人為 39.6%、黑種人為 30.9%(P=0.048);環孢素的清除率，在美國白人和美國黑人之間也有明顯的種族差異(P=0.0001)。

3 MDR1多態性與P-gp表達/功能的關系

MDR1多態性可通過改變基因的表達水平或P-gp蛋白的功能，最終影響藥物的體內代謝和效應。目前這方面的研究主要集中在C3435T上，并已證實該位點與P-gp的表達或功能有關，但在基因型與表型的關系上存在著明顯分歧，目前也無確切的解釋。2000年Hoffimeyers等［8］首次報道MDR1基因多態性與人類 P-gp表達相關，發現在白人中3435TT型個體十二指腸 P-gp的表達水平僅為3435CC型個體的33%，且 P-gp的低表達導致了3435TT型個體地高辛血漿藥物濃度的增高，由此引發廣泛關注。一些學者針對不同種族人群開展了類似的研究，但結論卻不一致。如Johne等［9］報道在白種人中3435TT基因型導致P-gp表達降低和地高辛血漿濃度升高;Taheri等［2］對伊朗乳腺癌人群的研究也發現TT基因型P-gp表達水平明顯低于CT和CC型，均支持上述報道。而Gerloff等［10］的研究則認為攜有3435T和3435C等位基因的健康高加索人P-gp表達和地高辛血漿濃度并無區別;但一項針對日本人群的研究結果卻相反，Nakamura等［11］在定量檢測十二指腸 MDR1表達時發現，攜帶3435T等位基因的日本正常人群MDR1 mRNA表達水平明顯高于C等位基因者。為此，姜志平等［12］對Pubmed來源的14篇“MDR1 C3435T基因多態性對環孢素體內代謝影響”的報道，進行薈萃分析，結果認為C3435T基因型和表型間的相關性可能存在種族差異。

另外，C3435T并非影響MDR1表達功能的唯一位點，多個SNP的聯合作用參與的途徑可能也需要考慮;如 Horinouchi等［13］研究認為 C3435T突變所導致的P-gp表達和功能改變，可能是因為其與G2677T的連鎖而得以借助G2677T錯義突變來實現。Vaclavikova等［14］研究發現 79.5%的乳腺癌組織中MDR1基因表達水平比非癌組織有所下調，認為與C3435T和C1236T的多態性有關。MDR1單體型分析可能有助于我們對單個SNP產生的不一致研究結果以及MDR1遺傳多態和功能復雜關系的全面理解。

4 MDR1多態性與乳腺癌化療或預后的關系

近年來隨著藥物基因組學的發展，有關MDR1多態性與乳腺癌療效、毒副反應以及預后的關系研究有了較大進展。Rodrigues等［15］研究發現化療后病理完全緩解的乳腺癌患者全部攜帶3435 CT或TT基因，沒有1例為 CC純合型。而 Cizmarikova等［16］的研究結果卻相反:攜帶3435 C等位基因的患者比T等位基因的患者有更高的化療反應率;CC純合型患者的中位進展時間為121.8個月，CT和TT型患者的中位進展時間為43.25個月，兩者間差異顯著。Chang等［17］針對轉移性乳腺癌的研究雖未發現C3435T與耐藥的關聯，但發現CT型患者總的生存期短于CC型。我們的實驗室研究(待發表)也發現乳腺癌患者C3435T變異與紫杉醇聯合蒽環類藥物的新輔助化療療效相關;TT基因型療效明顯低于C等位基因攜帶者，與日本、中國和韓國等亞洲人群的大部分研究結果相似［11，18-20］。另外，新近有研究認為MDR1單體型分析，可能比單相多態性具有更好的表型相關性。如 Lal等［21］研究發現C1236T、G2677T/A和C3435T的CC-GG-CC野生型患者與CT-GT-CT和TT-TT-TT變異型相比，體內多西紫杉醇清除明顯增高而血漿藥物峰濃度明顯下降;不過，Pan等［18］卻發現 2677G-3435C 單體型預示中國漢族非小細胞肺癌患者具有更好的紫杉醇-順鉑化療反應率。這些均提示，上述不同種族中可能存在的多態性與表型的不同關系，最終可能對療效也產生其種族特有的影響，值得進一步研究。

另外，在化療毒副反應方面，MDR1遺傳多態分析可能也具有一定的預測價值。如Tran等［22］發現MDR1 C3435T的TT、TC和CC型乳腺癌患者Ⅲ度白細胞減少癥的發生頻率分別為100%、77.3%和54.5%，推測C3435T多態性與化療毒副反應有關。Tsai等［23］發現在臺灣乳腺癌患者中2677GG型比攜帶變異型患者更易于出現發熱和白細胞減少。

5 MDR1基因和蛋白表達與化療及預后的關系

P-gp是人體許多正常組織中的正常蛋白，主要分布在具有排泄和分泌功能的細胞如肝臟、腎臟、小腸、胎盤、血腦屏障和造血干細胞中;可將有害的代謝物和外源性物質主動排出，保護細胞免受損害。在耐藥癌細胞、化療耐受患者的癌組織以及各種體外構建的MDR細胞培養模型中P-gp/MDR1均呈高表達，且表達水平與耐藥程度呈明顯正相關。

臨床檢測顯示，未經治療的乳腺癌患者癌組織中MDR1/P-gp表達率在26.0% ～67.5%，說明有相當一部分患者在治療前就已經有MDR的存在，表達MDR1的乳腺癌患者對MDR相關的化學藥物反應差，且與乳腺癌的分期、復發和預后也存在一定的關聯。楊曉文等［24］采用免疫組化法檢測乳腺癌組織P-gp的表達情況，發現28例新輔助化療患者，化療前癌組織P-pg的表達程度與56例乳腺癌未化療者癌組織相似，但在化療后P-gp的表達水平明顯升高，推測化療藥物會誘導P-gp蛋白的表達，因此檢測MDR1表達水平對臨床選擇化療方案具有重要意義，可將其作為制定化療方案和判斷預后的參考標準。

6 MDR1/P-gp多藥耐藥的逆轉

P-gp逆轉策略主要有(1)P-gp逆轉劑，通過特異性或競爭性地與P-gp結合來達到逆轉目的;(2)免疫治療，利用特異性抗體封閉 P-gp功能，如MRK16等;(3)基因治療，包括核酶技術、反義核酸技術和小分子干擾RNA技術等，在基因水平阻斷MDR1的作用。

目前，P-gp逆轉劑已經發展到第三代。第一、二代逆轉劑由于自身的劑量限制性毒性，或者與抗癌藥合用時干擾后者的藥代動力學，限制了其臨床應用。第三代逆轉劑有 S9788、XR9576和GF120918等，基本克服了以上缺點。如S9788是近年來發現的新型氨基哌啶類逆轉劑，臨床Ⅰ期試驗結果顯示，其發揮抑制P-gp泵功能的劑量，與阿霉素之間無藥代動力學方面的相互影響，不增加后者的毒性;此外中藥逆轉劑在逆轉耐藥方面也顯示出一定的效力，但他們的臨床效果還有待研究。

腫瘤細胞產生多藥耐藥的最主要原因是MDR1基因的過度表達以致其編碼蛋白的大量增加，因此，在基因水平逆轉MDR是解決此問題的根本。新近，小分子RNA(SiRNA)干擾技術的發展為腫瘤多藥耐藥逆轉提供了靶向性更強、逆轉效果更佳的技術手段［25］。一系列體外耐藥細胞模型的實驗研究均證實，通過RNA干擾能夠穩定而持久地“沉默”耐藥腫瘤細胞中MDR1基因的表達，成功克服P-gp介導的耐藥性，為腫瘤耐藥治療帶來了新希望。

7 結語

雖然絕大多數研究認為MDR1 C3435T變異在調節P-gp表達或功能上具有重要作用，但其調節機制以及最終對表達或藥效影響的結果目前均未能完全闡明;其他已知的SNPs及其單體型對P-gp蛋白表達或功能的影響，或不太明確或未能顯示明顯意義。其原因可能為:(1)存在種族差異，各種族間甚至同一種族不同地區間都存在MDR1多態性以及基因型與表型關系的差異;(2)研究位點較局限，除了C3435T、G2677T/A和C1236T外，還應發掘更新的位點并加強對單體型的研究;(3)單個SNP的影響可能較小，需要連鎖或聯合分析;(4)MDR1基因和蛋白表達的影響因素很多，如藥物相互作用和環境因素也很重要。為此，我們認為，在目前狀況下，不同人群MDR1遺傳多態和表型的聯合檢測與分析在臨床腫瘤化療耐藥或療效預測上可能更重要，我們也正在開展這方面的研究。由于腫瘤MDR是多種耐藥基因參與和不同機制共同作用的結果，因此耐藥相關多個通路上的基因及其SNPs的聯合檢測及表達譜的分析也需重視。如最近Stege等［25］報道在MCF-7乳腺癌細胞多種耐藥亞群中轉錄因子ETS1基因均呈高表達，并認為ETS1是通過上調MDR1的表達來誘導MDR的。

當然，在對上述MDR分子機制的全面認識以及耐藥準確預測的基礎上，有效開展MDR逆轉，也是臨床化療中亟待解決的問題。目前針對MDR的基因治療仍處于探索階段，在基因載體的選擇、靶基因在靶細胞內的特異性表達及基因治療生物安全性等方面還存在許多有待解決的問題。相信隨著這些問題的解決，多藥耐藥將不再是腫瘤藥物治療的障礙。

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