誘導多能干細胞相關載體的研究進展

曾岳岳， 黃正接， 羅 琪

2006年日本京都大學的Takahashi等［1］首次報道，將選擇的特定外源性轉錄因子導入小鼠的成纖維細胞，可以成功誘導出多能性的類胚胎干細胞，他們把這類細胞命名為——誘導多能干細胞(iPS cell)。這一新的突破在理論上首次證實了已分化成熟的體細胞同樣可以被重編程而轉化為類胚胎干細胞，且成功地解決了難以突破的倫理及免疫排斥問題，為再生醫學增加了一個新途徑。運用此重編程技術能從特定疾病的患者體內提取成體細胞，進而誘導成疾病特異iPS細胞。疾病特異iPS細胞的誘導成功更為體外研究遺傳疾病發生、發展和組織形成提供了更加廣泛和大量的研究模型，并將有力推動基因治療和藥物研發。但是，重編程外源基因組及使用病毒載體會影響iPS細胞基因組，即可能引發潛在的插入性腫瘤和干擾誘導多能干細胞分化。因此，尋找合適的載體是誘導多能干細胞技術的重要研究課題。載體是由質粒、噬菌體及病毒衍生而來的，具有攜帶功能的DNA分子，在載體中可插入外源基因片斷，通過轉化、轉染或利用病毒進入細胞的機制導入到一個宿主細胞中，并在其中進行復制或表達。

1 使用病毒載體誘導iPS細胞

1.1 以逆轉錄病毒和慢病毒為載體 2007年Okita 等［2］報道，以逆轉錄病毒為載體，將 Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4 4種因子導入人類成纖維細胞，成功誘導成類胚胎干細胞。幾乎與之同時，美國科學家Yu等［3］也成功地將人類成纖維細胞誘導成類胚胎干細胞。與Okita研究組所不同的是，Yu等運用的載體為慢病毒，所采用的轉錄因子是通過自篩而確定的4種因子組合，即 Oct3/4、Sox2、Nanog和 Lin28。結果顯示，生成的iPS細胞與人的類胚胎干細胞特性高度一致。隨后，研究小組將iPS細胞注入先天免疫缺陷的裸鼠皮下，得到包含三胚層細胞的畸胎瘤，進一步證實其具有類似胚胎干細胞的發育潛能。使用逆轉錄病毒或慢病毒作為載體轉染體細胞誘導成iPS細胞的方法，因其直接使外源性基因和載體整合到受體體內的基因組，會引起插入突變以干擾正常的iPS細胞系的功能，而細胞中殘余的外源因子序列的表達會影響分化，甚至有導致腫瘤發生的危險性。特別是原癌基因c-Myc的導入，由其構建的嵌合體小鼠中約20%發生了腫瘤［3］。因此，目前很多學者已采用其他方法替代原癌基因c-Myc的轉導，而以逆轉錄病毒和慢病毒為載體誘導iPS細胞的臨床應用也受到了極大的限制。

1.2 以腺病毒為載體 2008年 Stadtfeld等［4］報道，使用腺病毒載體(adenoviral vectors)轉染Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4 4種因子，成功地將小鼠肝細胞改造成iPS細胞。研究者使用聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)和 Southern blotting等方法未發現腺病毒載體基因組及轉導因子基因組整合到宿主細胞基因組中的跡象。與逆轉錄病毒、慢病毒相比，腺病毒載體可以使外源基因組不會整合到宿主細胞基因組當中，解決了外源基因組對iPS細胞分化干擾的難題。然而，以腺病毒為載體誘導iPS 細胞的效率非常低(0.000 1% ～0.001 8%)，比逆轉錄病毒為載體的誘導率(0.1%)低很多，這就限制了其臨床應用。

2 使用質粒載體誘導iPS細胞

2.1 以質粒為載體 2008年日本學者Okita等［5］使用質粒(plasmid)為載體，攜帶轉染所需的因子基因，成功地將小鼠成纖維細胞誘導成類胚胎干細胞——iPS細胞。這種方法不僅防止了病毒載體基因組整合到宿主細胞基因組中，同時可以防止外源基因干擾iPS細胞的分化。Okita等利用質粒的自我復制和轉錄等特性，設計了兩種攜帶轉染因子的質粒改造小鼠成纖維細胞，一種為pCX-OKS-2A，其由一段2A肽(來自口蹄疫病毒，具有自我清除作用)攜帶Oct4、Sox2和Klf4 3種轉導基因;另一種是pCX-c-Myc，由一段2A肽攜帶c-Myc轉染基因。兩種質粒經多次瞬間轉染，將小鼠成纖維細胞誘導成iPS細胞。此法大大消除了插入性腫瘤形成的風險及再激活癌基因的可能性。但其仍然無法突破一個障礙——iPS細胞誘導率極低。采用此法轉導1×106個成體細胞只成功改造了1～29個iPS細胞，而在同樣的實驗條件下，采用逆轉錄病毒作為載體卻能成功轉染1～1 000個iPS細胞［6］。西班牙學者Gonzalez等［7］改進了Okita研究組的方法，他們采用一個質粒載體就將小鼠胚胎成纖維細胞成功地誘導出iPS細胞。并設計出一個含Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc 4種轉導基因的多順反子質粒載體pCAG-OSKM，通過瞬間轉染的方法改造小鼠胚胎成纖維細胞成iPS細胞。但誘導率仍很低。

2.2 以oriP/EBNA1質粒為載體 Yu等［8］于2009年利用oriP/EBNA1質粒，首次生成無外源基因重編程的人iPS細胞。EBNA1和oriP是EB病毒(epstein-barr virus，EBV)中與復制和保持病毒基因組游離性的重要基因元件。具有oriP/EBNA1的質粒轉染人靶細胞后不整合，并可長期穩定存在，不會造成宿主細胞的突變。同時，由于其具有增強轉錄及免疫逃逸等功能，使質粒攜帶的目的基因能夠獲得較高的轉染效率［9］。Yu工作小組經研究得出，當oriP/EBNA1質粒只整合 Oct4、Sox2、Nanog及 Lin28 4種外源基因，其改造人新生兒包皮成纖維細胞的成功率為0.1%，但當再增加c-Myc和Klf4轉導基因后，其誘導成功率則增加10倍。

3 使用酶切系統誘導iPS細胞

3.1 利用 Cre/LoxP重組系統 Soldner等［10］從帕金森病患者身上提取成纖維細胞和利用強力霉素誘導的慢病毒載體，通過酶切Cre/LoxP重組系統成功地培育出不含外源基因的人iPS細胞。酶切Cre/LoxP系統可以使某一基因在特定的組織、細胞中，在細胞分化，成熟過程的某一時段被剔除，以減輕其帶來的副作用。這雖能除去外源因子序列，但載體序列仍會有殘留，因此仍可能造成插入性突變。此外采用這種方法誘導的成功率仍然很低，轉染Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc 4種基因后，其誘導成功率只有0.01%［11］。

3.2 利用piggyBac轉座子 Yusa等［12］報道，利用piggyBac轉座子方法，將小鼠胚胎成纖維細胞成功地改造成iPS細胞。piggyBac是一種從粉紋夜蛾(trichoplusia ni.)中分離到的、具有TTAA插入位點特異性的DNA轉座子。piggyBac可在昆蟲基因組中準確切離，轉化頻率較高，且不受宿主因子的限制［13］。Yusa研究小組設計了含有piggyBac轉座子系統、具有自我清除作用的F2A肽及T2A肽的載體，轉染 Oct4、Sox2、Klf4和 c-Myc基因。此載體能通過piggyBac轉座子系統形成的轉座酶及F2A肽和T2A肽切除插入的外源基因和載體序列，因此，得到的iPS細胞不會留下外源基因組的“足跡”［14］，可更好地應用于臨床。更重要的是利用piggyBac轉座子轉染 Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc和 Lin28 5 種基因能使轉導率達到1%，相當于以逆轉錄病毒為載體的轉導率［15］。

4 使用重組蛋白誘導iPS細胞

2009年 Zhou 等［16］將重組蛋白(Oct4-11R、Sox2-11R、Klf4-11R和c-Myc-11R)轉入小鼠胚胎成纖維細胞，成功地誘導出類胚胎干細胞——蛋白誘導多能干細胞(piPSC)。這一技術在誘導iPS細胞領域里產生了重大的突破，能在不涉及基因組調節的情況下，只憑借蛋白質就能將小鼠胚胎成纖維細胞誘導成iPS細胞，這一技術大大簡化了將細胞重編程為類胚胎干細胞的常用技術的繁瑣步驟。Zhou的研究小組首先將Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc 4種基因重編程大腸桿菌細胞，促使大腸桿菌表達4種基因，形成的蛋白經過正確折疊、修飾、純化和連接目標肽，在目標肽的引導下通過滲透法進入小鼠胚胎成纖維細胞，發揮誘導功能。實驗證實只有通過反復多次的轉入重組蛋白，才可能誘導出類胚胎干細胞。這種方法與之前誘導多功能干細胞的方法相比有以下2點優勢［17］:(1)有效地消除了外源基因和序列對細胞基因的修改造成的風險;(2)蛋白轉導的方法更加簡單快速、經濟實用。然而，缺點就是難以提高轉導效率，在轉導4種重組蛋白及組蛋白脫乙酰化酶抑制劑——丙戊酸(valproic acid，VPA)(也能提高Oct4、Sox2、和Klf4 3種基因誘導的成纖維細胞重編程效率［18］)的作用下，僅能將5×104個小鼠胚胎成纖維細胞成功改造得到3個iPS細胞。

5 結語

iPS細胞研究在短短幾年時間里已取得重大的突破，為避免重編程外源基因可能導致受體發生插入性腫瘤及影響細胞分化等潛在性危險，應盡量減少外源基因的整合。從2006年 Takahashi等轉導Oct4、Sox2、Klf4和 c-Myc等24種因子到如今 Kim等［19］只轉導Oct4一個基因就誘導得到iPS細胞，可見其研究進展是迅速的。科學家首次誘導iPS細胞使用了逆轉錄病毒，出現了載體的序列整合到宿主細胞基因組，存在癌基因激活的危險。因此，研究者又陸續研發了慢病毒、腺病毒、質粒載體，重組蛋白轉染成體細胞誘導得到iPS細胞，大大減少了外源基因的整合，然而科學家在設計出更安全的載體后，又普遍出現了誘導效率低下的困惑，這嚴重影響了誘導多能干細胞的臨床應用及藥物開發。因此，iPS細胞領域的研究者都期待著在不轉導外來基因組的情況下，通過蛋白轉導或尋找更適合的誘導細胞和載體技術，創造出更安全、更高效、更穩定的 iPS細胞。

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