CYP2C19基因多態性在江蘇及其周邊地區漢族人群的調查研究

顧連云,趙 萍

(南京醫科大學第一附屬醫院,江蘇南京,210029)

人細胞色素P450酶(Cytochrome P450)主要存在肝微粒體中,由3部分組成:血紅素蛋白,黃素蛋白和磷脂。約有30多個CYP450同工酶參與藥物的代謝,占主導地位的酶類有 4種:CYP2D6,CYP3A4,CYP1A2 和 CYP2C19。CYP2C19是CYP450超家族的一種同工酶,在藥物代謝中有重要作用,代謝降解40%～50%的藥物[1-3]。主要參與代謝的藥物有:質子泵抑制劑、三環類抗抑郁藥、抗癲癇藥、抗精神病藥、降糖藥、抗凝藥、抗瘧疾藥以及一些抗癌藥物等[4-7]。

CYP2C19藥物代謝有個體差異,而個體差異主要受遺傳因素與環境因素的共同影響。約14.3%的中國人和3.5%的歐洲人CYP2C19酶的功能降低或缺失。因此CYP2C19酶的活性在人群中呈現二態分布,即弱代謝者和強代謝者。到目前為止,已發現CYP2C19 m1～CYP2C19 m7突變等位基因,影響該基因的正常表達,致使CYP2C19酶的功能降低甚至缺失。所有突變等位基因是CYP2C19遺傳多態性的分子生物學基礎。其遺傳多態性也存在種族差異,在中國漢族人群中,CYP2C19基因突變的類型主要是CYP2C19＊2和CYP2C19＊3兩型。CYP2C19＊1為野生型基因,有催化活性,其余突變型均無催化活性。CYP2C19＊2和CYP2C19＊3在亞洲發生的突變頻率較高,與藥物代謝個體差異有很大關聯,是東方人慢代謝表型的主要遺傳突變類型,也是目前研究較深入的一類藥物代謝酶[8-9]。盡管CYP2C19占人肝微粒體CYP450的含量較小(0.8%～1.4%),但其酶缺陷在東方人中高達15%～23%,成為其酶代謝底物產生藥物效應個體差異和種族差異的主要原因,是藥物代謝酶分子遺傳藥理學研究領域中最為關注的靶目標之一。已有許多臨床研究認為CYP2C19基因多態性對其相關底物的藥動學和藥效學有一定影響,CYP2C19基因型可能是預計疾病恢復或愈合的決定因素[2,10]。因而CYP2C19基因多態性對于這些底物的治療優化或個體化可能會非常有用。本研究旨在了解江蘇及其周邊地區漢族人群CYP2C19的基因多態性的分布情況,為進一步探討臨床中CYP2C19基因多態性與藥物敏感性的個體化用藥方案提供資料。

1 資料與方法

1.1 研究對象

江蘇省人民醫院體檢的無血緣關系的健康人,共 81例,均為漢族人,無慢性疾病史,經過一般體檢、肝腎功能、血尿便常規、心電圖、胸片、乙型肝炎免疫指標檢查正常。入選者3月內未參加任何臨床藥物試驗,試驗開始前1周內未服用任何藥物,遵從臨床藥物試驗研究過程規定,簽署書面知情同意書。男42例,女39例,年齡(29.5±6.8)歲。

1.2 試劑和儀器

上海博彩PCR產物回收試劑盒,內切酶BamH Ⅰ和SmaⅠ,西班牙瓊脂糖;離心機(Eppendorf 5415D,德國);凝膠電泳圖像分析系統(JD801,江蘇省捷達科技發展有限公司)。脫氧核苷三磷酸(dNTP)、10×PCR反應緩沖液、Taq DNA聚合酶、鎂離子(日本 Toyobo公司);引物(上海生工生化公司);DNA分子量標記(Marker)、限制性內切酶緩沖液(Loading Buffer,美國Promega公司);PCR儀(PTC-200,美國MJ Research公司);電泳儀(D IY210C,北京六一儀器廠)。

1.3 CYP2C19基因型分析

1.3.1 CYP2C19 DNA擴增:全血基因組DNA的提取及純度測定:采用 DNA提取試劑盒(Promega公司,美國)進行DNA抽提。PCR擴增:以研究對象外周血提取的基因組DNA為模板,設計以下引物為實驗引物序列:

PCR 反應 體 系 20 μ L, 水 14.5 μ L;10 ×Buffer 2 μ L;10 mmol/L dNTP 0.4 μ L;10 μ mol/L 的上 、下游引物各 1 μ L;DNA Taq polymerase 0.2 μ L;DNA 1 μ L。反應參數為:95 ℃ 預變性5 min,94℃變性30 s,50℃退火30 s,72℃延伸1 min,共30個循環,最后72℃延伸5 min。擴增參數為:95℃預變性5 min,94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸1 min,共30個循環,最后72℃延伸5 min。選取擴增特異性良好的PCR樣本進行PCR產物回收,分別用限制性內切酶BamH Ⅰ和SmaⅠ進行酶切反應。3%瓊脂糖凝膠電泳,應用凝膠成像系統進行成像處理。典型PCR圖分別見圖1、2、3。

2 結 果

2.1 CYP2C19基因片段的酶切及受試者CYP2C19基因型的判定

CYP2C19 m1的等位基因擴增得到169 bp的片段,用限制性內切酶SmaⅠ經3 h酶切后,據酶切結果可判定關于CYP2C19 m1等位基因的CYP2C19基因型,CYP2C19 m2的等位基因擴增得到329 bp的片段,用限制性內切酶BamHI經3 h酶切后,據酶切結果可判定關于CYP2C19 m2等位基因的CYP2C19基因型,兩者結合的等位基因測定結果可判定受試者的 CYP2C19基因型。

圖1 PCR擴增產物圖

圖2 CYP2C19ml基因結果圖

圖3 CYP2C 19m2基因結果圖

3.2 CYP2C19基因型分布狀況

81例樣本CYP2C19的基因型經PCR-RFLP法檢測,統計結果見表1。分別針對CYP2C19＊2、＊3 2個等位基因突變點進行基因型分析,PMs有3種基因型(CYP2C19＊2/＊2,＊2/＊3或＊3/＊3),EMs有2種基因型,為純合子(＊1/＊1)和雜合子(＊1/＊2或＊1/＊3)。根據每個志愿者的2種基因變異結果,81名志愿者中純合子EMs組 31例,占38.3%;雜合子EMs組37例,占45.7%;PMs組 13例,弱代謝型所占比例約為16.0%。

表1 CYP2C19基因型及表型的統計結果

3 討 論

基因突變的多樣性決定了其表型的多樣性,等位基因的突變使酶活性降低,對藥物代謝的能力隨著等位基因的不同組合而呈現出一定的規律性,表現出正常基因純合子、正常基因與突變基因雜合子、突變基因純合子或雜合子的變化趨勢。CYP2C19的基因多態性分布具有明顯的種族和地域差異。中國是一個幅員遼闊的多民族國家,在遺傳背景大致相似的基礎上又有各自的特色[1,8]。中國人群的 CYP2C19變異主要是CYP2C19＊2和CYP2C19＊3兩型,這 2種變異幾乎涵蓋了中國人所有的PM。由于CYP2C19＊3的存在,使PM在中國人中的發生率較高,達到15%～17%。本試驗中,作者對81例健康志愿者進行CYP2C19基因型的分析,PM的發生率是16.0%(13/81)。

CYP2C19基因多態性影響其相關底物的藥動學和藥效學,因而產生不同的藥物臨床療效[2],因此CYP2C19基因型的檢測是必要的,它可能是臨床優化相關藥物治療作用的一種有用的工具,它可使臨床醫生決定藥物的選擇、治療劑量和療程,以及選擇最佳的聯合治療方案,對研究CYP2C19基因多態性與疾病、藥物療效、毒副作用的相關性有一定參考價值。從圖1可見,江蘇及周邊地區的弱代謝的比例低于蒙族人(33.3%)及海南黎族人(15%),高于獨龍族(11.2%),布依族(10.2%),苗族(9.2%),土族(9.0%),藏族(8.7%)和維吾爾族(4.17%)等[9-14]。說明CYP2C19的基因多態性分布是具有種族和地域差異的。

近年來基因導向個體化治療已在臨床應用,對指導臨床用藥極為重要。由于藥物反應存在個體差異,部分患者會導致治療失敗,部分患者甚至會因不良反應而死亡等。在美國約有0.32%的住院患者因藥物不良反應而死亡,在各類死亡原因中藥物不良反應死亡排名第4～6位[2]。基因導向個體化治療不僅可以預防上述情況發生,還可以幫助患者以最小的藥物劑量而獲取最佳的治療效果,真正體現出“因人用藥,量體裁衣”的原則。CYP2C19酶的活性還受許多藥物誘導或抑制酶的影響,如:巴比妥類、炔諾酮、利福平、潑尼松為誘導劑;西咪替丁、苯丙氨酯、氟西汀、帕羅西汀、氟伏沙明、吲哚美辛、酮康唑、奧美拉唑為抑制劑,它們之間也存在相互作用,對其療效的影響也應慎重考慮,因此在臨床聯合用藥時如何調整藥物劑量仍有待進一步研究[15-17]。

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