流式細胞儀檢測非小細胞肺癌患者活性循環內皮細胞初探

孫洪巖,張愛梅,操樂杰,李 慶,徐修才

(安徽省合肥市安徽醫科大學附屬省立醫院,安徽合肥,230001)

血管生成不僅為腫瘤生長提供新陳代謝的營養物質,也為腫瘤細胞的分化、轉移提供了潛在的路徑[1]。循環內皮細胞(CECs)在腫瘤血管新生和腫瘤生長方面起著重要作用,它可以作為反映腫瘤血管生成及監測抗血管治療藥物療效的標記物[2-3]。本研究以 CD45-PC5、CD146-PE、CD106-FITC抗體為標記,測得CD45-/dim CD146+為成熟的 CECs,CD45-/dim CD146+CD106+為活性CECs(aCECs),以了解非小細胞肺癌(NSCLC)患者與健康人群外周血CECs和aCECs數量上的差異。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本院呼吸科2009年9月～2010年7月期間收治的經組織病理學或細胞學確診的進展期NSCLC患者 60例,常規行胸部CT、腦 MRI、骨掃描及腹部 B超檢查,以2009年版國際肺癌TNM分期標準進行分期。并滿足以下標準:年齡>18歲;沒有缺血性心臟病、系統性脈管炎、肺動脈高壓、感染性疾病、糖尿病、免疫性疾病、其他原發性腫瘤;自愿加入本實驗,并簽定書面知情同意書。60例肺癌患者(NSCLC 56例)中男40例,女20例,中位年齡64歲(31～81歲)。鱗癌23例,腺癌32例,鱗腺癌1例,小細胞肺癌 4例。NSCLC患者中Ⅰ、Ⅱ期4例,Ⅲ期15例,Ⅳ期37例。選取本院體檢中心健康人群30例為對照組,男 19例,女 11例,中位年齡47歲(23～68歲)。

1.2 儀器與試劑

科大創新公司生產KDC-6000R低速冷凍離心機,美國Beckman-Coulter公司生產流式細胞儀(型號為 EPICS-XLⅡMCL;分析系統軟件為SystemⅡ)。淋巴細胞分離液(Cat:LTS1077)由天津灝洋生物有限公司生產,CD45-PE-Cy5抗體(PN:IM2653U)由Beckman-Coulter公司生產,CD146-PE抗體(Cat:550315)、CD106-FITC抗體(Cat:551146)均由美國BD Bioscience公司生產,溶血劑為0.83%的氯化銨溶液,由本實驗室用去離子蒸餾水自行配制。

1.3 方法

1.3.1 標本的采集:于治療前1 d抽取NSCLC患者1 mL靜脈血于血常規管中檢測血常規用,再取5 mL靜脈血于肝素鈉抗凝管中,4℃冰箱保存備用,2 h內進行標本檢測。健康對照組標本在本院體檢中心體檢時抽取。

1.3.2 標本的處理:取7.5 mL淋巴細胞分離液于專用離心管中,將5 mL肝素鈉抗凝管中外周血用塑料吸管緩慢加入淋巴細胞分離液面上;1 800 r/min離心15 min;棄去離心管上層血漿,取盡第2層環狀乳白色淋巴細胞層約1.5 mL,加3倍PBS液;1 300 r/min離心5 min;棄上清液,留取下層細胞懸液 100～200 μ L 備測;取50 μ L 備測細胞懸液到已加入 2 μ L CD45-PE-Cy5 、10 μ L CD146-PE、10 μ L CD106-FITC 的專用流式試管中,振蕩混勻,室溫避光孵育15 min;加入溶血劑500 μ L,振蕩混勻,室溫避光孵育 10 min;完全溶血后在15 min內上流式細胞儀檢測。

1.3.3 標本的檢測:檢測前常規對流式細胞儀進行光流路質量調控和熒光補償,使儀器各項指標在質量控制允許值范圍。檢測時首先根據前向(FSC)和側向(SSC)散射光信號對單個核細胞群(包括淋巴細胞及單核細胞)進行設門,以避免紅細胞、血小板、細胞碎片及中性粒細胞對檢測結果的影響,每份標本獲取設門內細胞在100000個以上,檢測后數據以Listmode文件形式保存。再以CD45(即CD45-/dim/+細胞群)設C門(占單個核細胞群的百分比為R1%),CD45-/dim CD146+的成熟CECs占門內百分比為R2%,CD45-/dim CD146+CD106+aCECs占門內百分比為R3%(圖1-3)。

1.3.4 CEC及aCECs的數量計算:根據同期患者的血常規檢查結果中淋巴細胞(L)及單核細胞(M)細胞數,把流式細胞儀檢測結果換算為每mL細胞數。CECs=(L+M)×R1%×R2%,aCECs=(L+M)×R1%×R3%。

圖1 CD45-/dim CD146+細胞流式圖

圖2 CD45-/dim CD106+細胞流式圖

圖3 CD45-/dim CD146+CD106+細胞流式圖

2 結 果

2.1 肺癌患者及健康對照組CECs、aCECs的數量

肺癌患者及健康對照組CECs、aCECs的檢測結果顯示。NSCLC與健康對照組比較,NSCLC患者CECs、aCECs的數量明顯高于健康人群,由于兩組樣本的CECs、aCECs總體方差不等(方差齊性檢驗 F=35.374、19.427,P<0.05),行校正 t檢驗,t′=8.437、6.113,差異有統計學意義(P<0.01)。

NSCLC與小細胞肺癌CECs、aCECs的數量比較 ,t=-0.347、0.617,P=0.73 、0.54,NSCLC與小細胞肺癌CECs、aCECs的數量差異無統計學意義(P>0.05)。

在NSCLC中鱗癌與腺癌比較,t=-0.214、-0.282,P=0.831、0.779,鱗癌與腺癌患者CECs、aCECs的數量無統計學差異(P>0.05)。

NSCLC中 CECs、aCECs的數量Ⅰ、Ⅱ期,Ⅲ期,Ⅳ期比較,方差分析 F=2.626、2.211,P=0.082、0.12,總體上 3組不同分期 NSCLC患者CECs、aCECs的數量無統計學差異(P>0.05)。兩兩比較Ⅰ、Ⅱ期與Ⅲ期,P=0.152、0.084,Ⅰ、Ⅱ期與Ⅳ期 P=0.782、0.388,Ⅲ期與Ⅳ期P=0.033、0.087。Ⅲ期CECs的數量明顯高于Ⅳ期(P<0.05),余各組之間 CECs、aCECs的數量均無統計學差異(P>0.05)。見表1。

表1 不同病理類型肺癌、不同臨床分期及健康對照組CECs/aCECs的比較(±s)

表1 不同病理類型肺癌、不同臨床分期及健康對照組CECs/aCECs的比較(±s)

與健康人群比較,＊＊P<0.01;與Ⅳ期比較,##P<0.01。

組別 n CECs/mL aCECs/mL非小細胞肺癌 56 2573±201.9＊＊ 784±91.4＊＊鱗癌 23 2539±180.6 755±65.3腺癌 32 2658±218.8 826±107.8小細胞肺癌 4 2958±376.8 500±31.4健康人群 30 273±21.0 35±6.1臨床分期 Ⅰ、Ⅱ 4 1953±42.0 276±18.4Ⅲ 15 3559±253.7## 1162±118.5##Ⅳ 37 2240±177.5 686±79.3

2.2 aCECs占CECs的比例

aCECs僅占CECs的一小部分。在NSCLC患者中aCECs占CECs的比例為29.9±17.3%,在健康對照組中占CECs的比例為8.4±13.6%。NSCLC患者aCECs的比例明顯高于健康人群,t=5.914,P<0.001,差異有統計學意義。見圖4。

圖4 NSCLC與健康人群aCECs占CECs的百分比

2.3 CECs、aCECs的數量與NSCLC腫瘤大小之間的關系

CECs、aCECs的數量與NSCLC腫瘤大小之間的關聯性分析 r=0.086、0.03,t=0.637、0.217,P=0.527、0.829。相關性無統計學意義(P>0.05)。

2.4 CECs、aCECs的數量與NSCLC血CEA之間的關系

CECs、aCECs的數量與NSCLC血CEA之間的關聯性分析 r=0.205、0.251。行 t檢驗,t=1.321、1.639,P=0.194、0.109。相關性無統計學意義(P>0.05)。

3 討 論

CECs在促進腫瘤血管生成過程中發揮重要作用,其數量可以反映腫瘤血管生成的的程度。在腫瘤患者中外周血CECs可以作為評估腫瘤的血管生成及抗血管生成治療療效的標志物[2-4]。近期研究進一步將CECs細化為休眠CECs(resting CECs)、活性 CECs(aCECs)及凋亡 CECs(apoptotic CECs),在CECs中大部分是rCECs、apoptotic CECs;僅少部分為aCECs,它可以反映腫瘤的新生血管生成的活力[5-7]。Wang等[8]認為aCECs可以作為NSCLC患者預測抗血管生成療效、反應預后的理想標志物。

盡管CECs的表型特征及檢測技術的標準化仍缺乏一致性,但普遍認為[9]CECs表達內皮細胞標志物如CD31、CD146等,而不表達造血細胞(CD45)及內皮祖細胞(CD133)標志物,aCECs還表達CD106。不同研究分別以多種CD分子標記物檢測出 CECs及 aCECs[5-6,9]。由于 CECs、aCECs在外周血中的數量較少,前期實驗采用全血三標的流式細胞儀檢測方法檢測了CECs的存在及其百分比結果,并試驗性的檢測了aCECs的結果,僅極少數肺癌血標本檢測出了aCECs的存在[10]。本實驗以Duda等[11]用淋巴細胞分離液對標本進行富集處理(提取單個核細胞)流式細胞儀檢測CECs的方法為基礎,以目前被廣泛認可的 CD45、CD146、CD106抗體為標記,通過 CD45-來排除造血細胞及活化的 T淋巴細胞。測得CD45-/dim CD146+為成熟的 CECs,CD45-/dim CD146+CD106+為 aCECs。Strijbos等[12]認為CECs與血小板之間存在抗原交叉現象,一些較大的血小板團塊也表現為CD45-CD31++CD146+。因此本實驗上機檢測在單個核細胞群設門,每份標本獲取設門內細胞要在100 000個以上,以避免紅細胞、血小板、細胞碎片、中性粒細胞及其他非特異反應等多種因素影響檢測結果,便于CECs及aCECs的計數。在樣本處理過程中需注意樣本室溫長時間存儲會影響CECs活性及表型,故在不能立即檢測樣本時應將樣本處于4℃冰箱保存備用;在加入溶血劑完全溶血后應在15 min內上流式細胞儀檢測,溶血時間過長會產生過多的細胞碎片,干擾檢測結果。

在肺癌患者外周血中存在大量的活化T淋巴細胞(CD45+CD146+),前期實驗也發現了上述現象[10]。因此單憑CD146+來測定CECs的方法存在很大的局限性和誤差,多種抗體標記聯合應用可以明顯提高CECs檢測的準確性和特異性。

NSCLC患者 CECs、aCECs的數量及 aCECs占CECs百分比都明顯高于健康人群(P<0.001),與文獻報道一致[5-6]。在CECs中aCECs僅占CECs的一小部分,其余大部分是 rCECs、apoptotic CECs;NSCLC患者CECs比健康人群高10倍左右,aCECs則高于健康人群近20倍,CECs可以作為很好的標記物來NSCLC血管生成狀況,而aCECs則更能反映NSCLC新生血管生成的活力。CECs、aCECs的數量在肺癌的病理分型上無統計學差異(P>0.05),其與NSCLC腫瘤大小及血CEA的水平無明顯相關性(P>0.05),與相關報道[10,13]結果一致。在NSCLC的臨床分期上,Ⅰ、Ⅱ期的CECs、aCECs數量均低于Ⅲ期、Ⅳ期,并以Ⅲ期為最高,但總體上3組間的差異無統計學意義(P>0.05),與文獻報道一致[10,13]。由于本實驗樣本量相對較少,類似相關研究不多,CECs、aCECs的數量在 NSCLC、小細胞肺癌乃至NSCLC不同病理類型、不同臨床分期上的差別還有待于進一步檢測,以便進一步評估肺癌的血管生成情況,為抗血管生成治療病人的合理選擇及療效評估提供依據。

采用富集處理(提取單個核細胞)的方法進行流式細胞儀分析能夠成功地檢測出CECs、aCECs,其在aCECs檢測上明顯優于前期全血試驗性的檢測結果。由于CECs在外周血中的數量較少,更多地收集流式細胞儀設門內的細胞數,能夠提高檢測結果的準確性及可靠性,其在不同功能狀態CECs的檢測上將會充分顯示出它的優勢,這為進一步檢測休眠 CECs、活性 CECs、凋亡CECs及循環內皮祖細胞(circulating endothelial progenitors,CEPs)奠定了基礎,以明確不同類型CECs及 CEPs的活力、動力學特征及其在NSCLC血管生成中的作用及意義。相信隨著CECs檢測技術的不斷完善,CECs、aCECs以及其他類型CECs和CEPs將會成為很好的標記物去監測NSCLC血管生成狀況、抗血管生成藥物療效及預后。

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