COX-2在人肝細胞癌中的表達及其對耐藥性的影響

何友釗,李 波,劉 勇,蘇 松,袁 慶,陳 川,張孟瑜,劉長安,龔建平

(1.江蘇省無錫市第三人民醫院肝膽外科,江蘇無錫,214041;2.四川瀘州醫學院附屬醫院肝膽外科,四川瀘州,646000;3.重慶醫科大學附屬第二醫院肝膽外科,重慶,400010)

肝細胞肝癌(HCC)對多種化療藥物具有耐藥性在臨床較為常見,其主要原因之一是HCC細胞中存在多藥耐藥基因(mdr1)及其產物P-糖蛋白(P-gp)和其他耐藥基因及其蛋白表達的過度表達。誘導型環氧合酶-2(COX-2)與腫瘤的關系早已被人們關注,研究發現COX-2與HCC的發生、發展有密切關系,但COX-2在HCC耐藥性中的作用機制尚不明確,本研究對此進行探討。

1 材料與方法

1.1 研究對象

肝細胞癌患者52例,均來自本院2003年10月～2005年6月期間肝膽外科住院病人,男39例,女13例,年齡 28～76歲,平均 51.4歲;其中36例患者術前檢查HBsAg陽性,30例患者存在不同程度的肝硬化,32例患者AFP≥400 μ g/L,術前Child肝功能分級A級24人,B級28人,按國際抗癌協會的TNM分期標準Ⅰ期23例,Ⅱ期15例,Ⅲ期14例。腫瘤直徑在1.5～11.0 cm,平均3.8 cm;患者術前均未行放、化療,所有患者均在全麻下行肝癌切除術,并取部分正常肝組織,術后病理切片檢查均為原發性肝細胞癌,50例為結節型肝癌,2例為巨塊型肝癌。

1.2 試劑與引物

鼠抗人P-糖蛋白單克隆抗體購自福州邁新生物技術開發公司,鼠抗人COX-2單克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司,DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物技術有限公司。COX-2基 因 上 游 引 物:5′-AAAGAAT TCATGCTCGCCCGCGCCCTCT-3′,下游引物序列 :5′-AAATCTAGATTATGACTGTCTTGAAAA A-3′,擴增片段328 bp:mdr1基因上游引物:5′-AAAGAATTCGCTCATTCGAGTAGCGGCTC-3′, 下游引物:5′-AAAGTCGACTTACC T TTTATTGTTCAGT T-3′,擴增片段 401 bp;β-actin上游引物:5′-AAATGGCAC CACACCT TCTACAA-3′, 下 游 引 物:5′-AAAGCAGCTCGTAGCTCTTCTC C-3′,擴增片段372 bp。

1.3 RT-PCR檢測COX-2 mRNA和mdr1 mRNA的表達

從60例原發性肝癌中隨機抽取52例,無菌條件下切取原發性肝癌及癌周2 cm處肝組織新鮮標本,按 TRIZOL試劑盒說明提取組織總RNA,采用RT-PCR檢測其COX-2 mRNA和mdr1 mRNA的表達。RT-PCR條件:50℃預變性30 min,94℃變性2 min,55℃退火30 s,72℃延伸 1 min,擴增30個循環,最后72℃補平7 min。取10 μ L擴增產物在1%瓊脂糖凝膠在紫外分析儀下觀察結果,用Bio-Rad Doc Gel 2000凝膠成像分析系統進行拍照。結果以相對光密度值(relative optical density,ROD)×面積(A)表示。mRNA相對含量=(目的基因條帶ROD×A)/(βactin條帶 ROD×A)。

1.4 免疫組織化學SP法檢測COX-2蛋白和P-gp蛋白表達

全部病理標本經4%甲醛固定,梯度酒精脫水、二甲苯透明后石蠟包埋,普通切片機連續切片(4 μ m),以3%H2O2阻斷內源性過氧化物酶。用10%BSA封閉以減少非特異性著色。再加入相應一抗(抗COX-2或P-gp抗體),4℃孵育過夜,PBS洗滌3次后加入1∶200生物素標記的二抗工作液,37℃孵育30 min;滴加濃度為1∶200的辣根酶標記鏈霉卵白素工作液,37℃孵育30 min;顯微鏡下監測DAB顯色,蘇木精復染,常規脫水、透明、封片。實驗以封閉液代替一抗作陰性對照。兩者染色均為棕黃色,在200倍光鏡下至少觀察5個視野,計數100個細胞中腫瘤染色細胞,(-)陰性:細胞陽性數<10%。(+)陽性:>10%的細胞數呈陽性反應。( )強陽性:>50%的細胞數呈陽性反應。

2 結 果

2.1 COX-2 mRNA和mdr 1 mRNA在肝癌組織中的表達

RT-PCR結果顯示COX-2 mRNA在正常肝組織中無表達,52例HCC組織中有44例HCC組織和癌旁組織中均有表達,其相對表達量分別為0.724±0.050和0.420±0.068,兩者比較有顯著性差別(P<0.01),其中,11例高分化和32例中、低分化的HCC組織中COX-2mRNA的相對表達量分別為0.698±0.044和0.762±0.041(P<0.05),在不同臨床分期、腫瘤大小、AFP水平、有無轉移的HCC組織之間COX-2 mRNA相對表達量無顯著性差別(P>0.05)。RT-PCR顯示mdr 1 mRNA在HCC組織、癌旁組織和正常肝組織中均有表達,在HCC組織和癌旁組織中相對表達量分別為0.675±0.036和0.548±0.033(圖 1)。

圖1 RT-PCR檢測COX-2 mRNA、mdr1mRNA的表達

2.2 COX-2和P-gp在肝癌組織中的表達

COX-2的表達主要定位于胞質,陽性物質呈棕黃色顆粒狀(圖2),COX-2蛋白在HCC組織和癌旁組織中的陽性表達率分別為82.7%和23.1%,COX-2在癌組織中的表達明顯高于相應的癌旁組織(P<0.01)。P-gp表達主要位于肝癌細胞膜上,少量位于胞質內,在HCC組織和癌旁組織中的陽性表達率分別為86.6%和30.7%,P-gp在癌組織中的表達明顯高于相應的癌旁組織(P<0.01)。

圖2 COX-2和P-gp在HCC組織中的表達

2.3 COX-2 mRNA與mdr 1 mRNA在HCC組織中表達的相關性分析

全部HCC組織中有42例同時表達出COX-2 mRNA和mdr 1 mRNA,兩者的相對表達量分別為0.725±0.050和0.574±0.036,相關分析表明COX-2 mRNA與mdr 1 mRNA在HCC組織的表達呈顯著的正相關關系(r=0.563,P<0.01,圖3)。

圖3 COX-2mRNA與mdr 1 mRNA在HCC組織相對表達量關系的散點圖

2.4 COX-2的表達與HCC臨床病理特征的關系

將52例HCC標本按分化程度、是否合并HBsAg及肝硬化、腫瘤大小、AFP水平、TNM 分期及是否轉移等臨床特征分類,統計COX-2的陽性表達與HCC組織臨床特征的關系(表1)。由表1可見,在癌組織中,高分化的HCC組織COX-2的表達陽性率為61.1%(11/18),低分化及分化較差的HCC組織為94.1%(32/34),分化程度高的HCC組織中COX-2的陽性表達率明顯低于低分化及分化較差HCC組織中COX-2的表達。HBsAg陽性HCC組織中COX-2表達率91.7%(33/36)明顯高于HBsAg陰性HCC組織中COX-2的表達 62.5%(10/16,P<0.05)。

表1 C OX-2表達與HC C臨床病理特征的關系

3 討 論

環氧化酶(COX)是花生四烯酸或其他二十碳脂肪酸轉化為前列腺素的關鍵限速酶,主要參與機體的炎癥和腫瘤的發生、發展,其中COX-2通過抑制腫瘤細胞凋亡,抑制免疫應答,促進腫瘤新生血管的形成等機制,參與了腫瘤的發生、發展過程[1]。近年來研究表明,COX-2與腫瘤發生具有明顯關系,許多腫瘤,如結腸癌,乳腺癌,前列腺癌,肺癌,肝癌等COX-2呈高表達狀態,并在腫瘤的發生、發展及轉移中起重要的作用[2]。在HCC組織中COX-2表達與分化程度有密切關系,總體而言在正常肝臟組織中COX-2不表達,高分化HCC組織中COX-2的表達明顯強于中、低分化的HCC組織,早期HCC通常分化較好,提示COX-2在HCC發生的早期階段起著重要作用[3]。在高分化的HCC,COX-2表達高于低分化的HCC和正常肝組織,表明COX-2可能在HCC發生早期具有重要作用,在HCC病人COX-2表達增加其預后較差,在慢性肝炎組織尤其是肝硬化組織中COX-2的表達也是顯著升高的,因此,COX-2在肝硬化進展為HCC的過程中起重要的促進作用,可能是COX-2過度表達改變了細胞凋亡和增殖相關基因的表達,促進了細胞發生惡性變化[4]。但是,我們檢測表明中、低分化HCC組織中 COX-2陽性表達高于分化較好的HCC組織,COX-2陽性表達在HBsAg陽性HCC組織高于HBsAg陰性的HCC組織,推測COX-2在乙肝患者中HBV引起肝細胞的變性過程中起著重要作用。此外,我們發現COX-2的表達水平與AFP表達高低、是否轉移、腫瘤大小以及臨床病理分期無顯著相關,提示COX-2的表達與HCC的預后關系不大。

多藥耐藥現象(MDR)是導致HCC化療失敗的主要因素,MDR是指腫瘤對某種抗腫瘤藥產生耐藥性的同時對結構和作用機制不同的其他抗腫瘤藥產生交叉耐藥的現象。肝癌的MDR形成的機制較為復雜,與多種耐藥基因及其蛋白表達有密切關系,但是mdr1基因和P-gp是導致肝癌具有MDR的主要機制。P-gp是細胞膜蛋白,ATP結合盒轉運蛋白超家族成員,通過消耗能量從腫瘤細胞中泵出抗癌藥物。已有證據表明,在HCC多藥耐藥性與COX-2過度表達有關,COX-2過度表達可以上調 mdr1基因和P-gp的表達[5]。有研究表明肝癌細胞MDR的形成同時伴有COX-2和誘導型一氧化氮合酶的表達。P-gp和COX-2常常同時在HCC表達增強,與MDR有關并且預后較差,COX-2可以誘導P-gp表達,使用COX-2特異性抑制劑塞來昔布(Celecoxib)作用于表達P-gp的HCC耐藥株,發現10 mmol/L的塞來昔布可以減低P-gp、Bcl-xL和Bcl-2表達,在MDR肝癌細胞誘導Bax從胞漿易位到線粒體,導致細胞色素c釋放至胞漿,原因在于caspase-3活化導致凋亡增加,50 mmol/L的塞來昔布輕微增加COX-2和P-gp的表達,沒有改變Bcl-xL和Bcl-2的表達[6]。本研究表明COX-2和P-gp在肝細胞癌中表達具有明顯的相關性,證實了COX-2參與了HCC的多藥耐藥機制。COX-2可以作為逆轉HCC耐藥性的一個靶點,選擇性抑制COX-2活性可能作用于P-gp,增加抗癌藥物濃度,降低對抗癌藥物的耐藥性,增強常規化療療效。

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