慢性乙型肝炎患者CD4+CD25+調節性T細胞及部分細胞因子的變化

王小鳳,彭雁忠,童新燈,湯熾良,陳麗嘉,武 敬,王鳳卿,黃清清

(北京大學深圳醫院感染性疾病科,廣東深圳,518036)

慢性乙型肝炎是乙型肝炎病毒感染而引起的 肝臟慢性炎癥。目前,世界上約有3.5億HBV攜帶者,其中每年15%～40%發展為肝硬化、肝細胞癌,給人類健康帶來極大的危害。作為全球感染率最高的國家,中國有1.3億HBV攜帶者,約2.3千萬CHB患者[1]。據報道,CD4+CD25+調節性T細胞(Treg)和Th1/Th2的失衡均可導致乙型肝炎慢性化[2-3]。本文就 CHB患者 CD4+CD25+Treg及部分細胞因子的變化進行研究,現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2008年10月～2009年9月期間北京大學深圳醫院感染性疾病科收治的臨床確診CHB患者 24例[男20例,女4例,年齡(35.92±1.52)歲]作為CHB組,AHB患者8例[男4例,女4例,年齡(35.50±3.05)歲]作為AHB 組,健康體檢者12例[男6例,女6例,年齡(25.33±0.26)歲]作為對照組。診斷符合2005年中華醫學會肝病學分會制定《慢性乙型肝炎防治指南》[4]的標準,并排除其他肝炎病毒感染及合并自身免疫性、酒精性肝病等。所有操作程序均符合倫理協會制定的倫理學標準,且所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑和儀器

CD4-FITC、CD25-PE、IgG1-FITC、IgG2a-PE和 Optlyse c溶血液,購自美國 BECKMAN COULTER公司。Epics XL型流式細胞儀檢測CD4+CD25+調節性T細胞;AU5400生化分析儀檢測肝功能,試劑由日本奧林巴斯公司提供;熒光定量RT-PCR法檢測血清HBV-DNA,試劑盒由達安公司提供。ELISA雙抗體夾心法測定血清中 IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ和 TGF-β的含量,試劑盒由武漢博士德公司提供。

1.3 方法

流式細胞儀檢測CD4+CD25+調節性T細胞百分率:①采集所有研究對象的新鮮外周血(EDTA-K2抗凝),設同型對照和檢測管。②檢測管中加入抗人CD4-FITC/CD25-PE單克隆熒光標記的抗體各20 μ L,同型對照管中加入IgG1-FITC/IgG2a-PE單克隆熒光標記的抗體各20 μ L。③分別加入100 μ L新鮮抗凝全血,混勻,室溫下避光放置15 min。④加入 500 μ L Optlyse c溶血液,混勻,室溫下避光放置10 min。⑤加入500 μ L PBS,室溫下避光放置 10 min,1 500 r/min離心5 min后棄上清。再用2 mL PBS洗滌,1 500 r/min 5 min后棄上清。最后加入500 μ L PBS懸浮細胞,24 h內檢測。用標準微球進行光路和流路的校正,利用同型對照管調整電壓,上機計數5 000個淋巴細胞,使用XL2軟件收獲檢測管細胞數據并進行分析。

AU5400生化分析儀進行肝功能檢測,熒光定量RT-PCR法檢測血清HBV-DNA,ELISA雙抗體夾心法檢測細胞因子。所有操作均嚴格依照說明書進行。

2 結 果

2.1 各組一般資料(表1)

表1 一般資料(±s)

表1 一般資料(±s)

組別 例數 年齡 ALT(U/L)HBV-DNA(copies/L)CHB組 24 35.92±1.52492.15±83.49(5.9±1.4)×107 AHB組 8 35.50±3.05612.24±116.13(1.5±1.0)×107對照組 12 25.33±0.26 24.33±2.05 -

2.2 各組CD4+CD25+Treg百分率

單因素方差分析顯示,CHB組CD4+CD25+Treg百分率均明顯高于AHB組和正常對照組(P<0.01)。AHB組與正常對照組之間的差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組外周血CD4+CD25+Treg百分率(±s)

表2 各組外周血CD4+CD25+Treg百分率(±s)

與CHB組比較,＊＊P<0.01。

組別 例數 CD4+CD25+Treg百分率CHB組 24 14.93±0.60 AHB組 8 8.64±0.75＊＊對照組 12 9.06±0.35＊＊

2.3 CD4+CD25+Treg與HBV-DNA、血清ALT的相關性

通過pearson相關系數檢驗發現CHB組和AHB組CD4+CD25+Treg與HBV-DNA之間無明顯相關性(r=0.232,P=0.276;r=0.34,P=0.409);CHB組和AHB組CD4+CD25+Treg與ALT之間無明顯相關性(r=0.196,P=0.357;r=-0.368,P=0.369)。

2.4 細胞因子的測定

所有檢測結果單位為pg/mL。CHB組IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ及 TGF-β水平較正常對照組明顯升高(P<0.01),差異有統計學意義。見表3。

表3 CHB組和正常對照組IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ和 TGF-β的水平(±s,pg/mL)

表3 CHB組和正常對照組IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ和 TGF-β的水平(±s,pg/mL)

與對照組比較,＊＊P<0.01。

組別 例數 IL-2 IL-4 IL-10 IFN-γ TGF-β CHB組 24 31.27±3.16＊＊ 52.12±2.65＊＊ 165.78±11.33＊＊ 76.25±1.70＊＊ 10.96±0.83＊＊對照組 12 14.68±1.77 25.06±2.66 84.49±3.21 43.00±2.92 5.73±0.64

2.5 IL-2、IFN-γ與血清ALT的相關性

CHB組IL-2、IFN-γ與血清ALT的相關性:通過pearson相關系數檢驗發現,CHB組IL-2和IFN-γ分別與血清ALT水平正相關(r=0.442,P=0.030;r=0.469,P=0.021)。

3 討 論

CD4+CD25+Treg為免疫系統中一類起負性調節功能的細胞,約占外周血CD4+T細胞的5%～10%,由 Sakaguchi等[5]在1995年首次報道。它涉及臨床多個領域,包括抑制自身免疫性疾病、移植物抗宿主病,誘導母胎免疫耐受,導致腫瘤、感染性疾病的發生、發展,其主要分子標志物有Foxp3、GITR、CTLA-4等。體內試驗表明,CD4+CD25+T reg可分泌 IL-10和 TGF-β,全面抑制CD4+及CD8+T細胞的活化[6-7]。目前多數觀點認為CD4+CD25+Treg可抑制HBV抗原特異性T細胞反應,與CHB的慢性化有關。CD4+CD25+Treg在AHB中隨病程發展而變化,具體表現為,初始期降低,恢復期上升,痊愈后恢復正常水平,推測與不同病程階段CD4+CD25+Treg的功能不同有關[3]。

T淋巴細胞主要介導細胞免疫,根據功能的不同,可分為輔助性T細胞(helper T cells,Th)、細胞毒性T細胞和調節性T細胞。其中,Th分為Th1、Th2、Th3三種亞型。Th1主要分泌 IFN-γ、IL-2、TNF 等細胞因子,主要促進細胞免疫,但反應過度將會引起組織損傷,亦稱為促炎性T細胞。Th2主要分泌 IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13等細胞因子,可增強B細胞介導的體液免疫。Th3分泌大量TGF-β,對免疫應答發揮負性調節作用。通常,以IFN-γ和IL-4反映體內Th1和Th2水平。Th1/Th2之間的平衡,維持機體正常的免疫狀態。

Akpolat N等[8]檢測30例CHB患者血清中TNF-α、IL-4、IFN-γ、TGF-β含量 ,對肝組織進行活檢后發現,TNF-α、IL-4和 TGF-β水平明顯高于健康對照組,認為 IL-4、TGF-β均與CHB的病情進展有關。Jiang R等[9]采用熒光激活細胞分類儀分析CHB和正常對照者的PBMCs中IL-4、TGF-β、IFN-γ的表達,發現 CHB 患者 PBMCs中大部分CD4+T細胞為Th0,在肝炎活動期,Th1明顯增多,而Th2變化不大。他們認為,Th1與肝臟炎癥正相關,Th2與HBV持續感染有關。Lee M等[10]采用RT-PCR法檢測CHB患者和正常對照者 PBMCs的 IL-2、IL-4、IL-10和 IFN-γ的表達,發現IFN-γ與ALT水平呈正相關。以上說明,感染HBV后,體內 Th1/Th2出現失衡,表現為免疫損傷或HBV免疫逃避,Th1占優勢,表現為CHB的急性期,Th2占優勢,表現為CHB持續狀態。

本試驗共選取慢性乙型肝炎患者24例,急性乙型肝炎患者8例,正常對照者12例。慢性乙型肝炎組CD4+CD25+Treg百分率均明顯高于正常對照組和急性乙型肝炎組,而急性乙型肝炎組與正常對照組之間差異無統計學意義,與田瑛等[11]在2007年的一項研究結果一致。另外,本試驗發現,慢性乙型肝炎組和急性乙型肝炎組 CD4+CD25+T reg百分率與HBV-DNA含量無明顯相關性,提示乙型肝炎病毒并非疾病慢性化的主要原因。關于CD4+CD25+T reg與ALT之間的關系,Lin CY等認為肝臟的損傷可增強慢乙肝患者Treg的抑制活性,他們在體外試驗中發現,外周血Treg百分率與血清ALT水平成正比,去除Treg后,血清 ALT較高的患者 HBV特異性CD8+T細胞的增殖反應明顯高于血清ALT較低的患者[12]。但國內外大量研究都指出,外周血CD4+CD25+Tregs頻率與血清ALT水平無相關性[1,13]。本試驗也未發現外周血CD4+CD25+Tregs頻率與血清ALT之間存在相關性。

同時,本試驗分析了24例慢性乙型肝炎患者和12例正常對照者的血清,分別檢測IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ及 TGF-β的水平。結果表明,CHB 組血清IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ及TGF-β水平均高于正常對照組,結果有統計學意義。IL-10和TGF-β作為CD4+CD25+Treg分泌的細胞因子,其升高提示,CD4+CD25+Treg作為抑制性免疫細胞,通過分泌IL-10和 TGF-β,下調免疫功能,抑制CD4+T細胞和CD8+T細胞的活化,阻礙HBV的清除,導致乙肝病毒肝炎慢性化的發生和發展。Th3、Th2和 Tr1也分泌 IL-10和TGF-β,IL-10和 TGF-β的升高,一定程度上反映Th3、Th2、T r1活躍。IL-4作為 Th2的主要效應因子,提示Th2占優勢,機體以體液免疫為主,細胞免疫功能受到抑制,出現Th1/Th2的失衡。而IL-2及IFN-γ作為炎癥因子,其水平亦較對照組升高,同時,本實驗比較了CHB組IL-2、IFN-γ分別與血清ALT的相關性,發現IL-2和IFN-γ分別與血清ALT水平正相關(r=0.442,P<0.05;r=0.469,P<0.05),與Priimiagi LS等[14]報道相符。說明Th1可誘發肝臟炎癥活動,同時,體內Th2細胞因子能拮抗Th1細胞因子的作用,減輕肝臟炎癥反應,維持HBV慢性化感染。

慢性乙型肝炎患者CD4+CD25+Treg百分率和Th1、Th2細胞因子均明顯高于正常對照者,提示慢性乙型肝炎患者存在免疫紊亂,CD4+CD25+Treg和 Th1/Th2失衡均與其慢性化有關。但是,CD4+CD25+Treg和Th1/Th2失衡在HBV感染慢性化過程中的具體機制仍未完全明確,本研究亦未對CHB患者抗病毒治療前后的CD4+CD25+Treg百分率和Th1、Th2細胞因子水平進行分析,有待進一步研究,為慢性乙型肝炎的臨床免疫治療提供更多的依據。

[1] Xu D P,Fu J L,Jin L,et al.Circulating and liver resident CD4+CD25+regulatory T cells actively influence the antiviral immune response and disease progression in patients with hepatitis B[J].Immunology,2006,177(1):739.

[2] 陳群,王更生,馬麗.CpG ODN聯合乙肝疫苗對小鼠免疫應答效果的影響[J].實用臨床醫藥雜志,2005,9(5):42.

[3] Fu J L,Xu D P,Zhao P,et al.T he characterization of regulatory T cells in peripheral blood of HBV-infected patients[J].Zhonghua Yixue Zazhi,2006,86(22):1522.

[4] 福軍亮,徐東平,趙平,等.急慢性乙型肝炎患者外周血調節性T細胞鑒定與臨床意義分析[J].中華醫學雜志,2006,86(22):1522.

[5] Chinese Society of Hepatology and Chinese Society of Infecious Diseases,Chinese Medical Association.The guideline of prevention and treatmentforchronic hepatitis B[J].Zhonghua Ganzangbing Zazhi,2005,13(12):881.

[6] 中華醫學會肝病學分會、感染病學分會.慢性乙型肝炎防治指南[J].中華肝臟雜志,2005,13(12):881.

[7] Sakaguchi S,Sakaguchi N,Asano M,et al.Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains(CD25).Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases[J].J Immunol,1995,155(3):1151.

[8] Li W P.The mechanism of immunoloregulation and prog ression of cinical studies of CD4+CD25+Treg[J].Xiandai Mianyixue,2006,26(2):164.

[9] 余紅嵐,劉若英,宋靜芳,等.病毒性乙型肝炎患者T h細胞亞群與ALT、IgG、C3的相關性研究[J].貴陽醫學院學報,2004,29(2):118.

[10] Ochs H D,Oukka M,Torgerson T R.TH17 cells and regulatory T cells in primary immunodeficiency diseases[J].J Allergy Clin Immunol,2009,123(5):977.

[11] Akpolat N,Yahsi S,Godekmerdan A,et al.Relationship between serum cytokine levels and histopathological changes of liver in patients with hepatitis B[J].World J Gastroenterol,2005,11(21):3260.

[12] Jiang R,Feng X,Guo Y,et al.T helper cells in patients with chronic hepatitis B virus infection[J].Chin Med J,2002,115(3):422.

[13] Lee M,Lee M,Lee S K,et al.Expression of Th1 and T h2 type cytokines responding to HBsAg and HBxAg in chronic hepatitis B patients[J].J Korean M ed Sci,1999,14(2):175.

[14] Tian Y,Qiu Z F,Li T S.The difference and significance of peripheral blood regulatory T cells in patients with symptomatic chronic hepatitis B,asymptomatic HBV carriers and acute self-limiting HBV infection[J].Zhonghua Weishengwu He Mianyixue Zazhi,2007,27(9):831.