心肌炎后大鼠左心室重構的實驗研究

李 偉,張振剛

(揚州大學第二臨床醫學院江蘇省揚州市第一人民醫院心血管內科,江蘇揚州,225001)

心肌炎(嗜心肌病毒感染或自身免疫性炎癥)導致的擴張型心肌病(DCM)日益受到重視。Jay W Mason提出了心肌炎的三步級聯學說,闡述了心肌炎和DCM的內在聯系,即由急性炎癥反應期,自身免疫介導的慢性遷延期,心肌纖維化、心室重構的三階段模式導致DCM的發生[1]。因而,在心肌炎向DCM的轉化過程中炎癥因子相關的左心室重構起到了至關重要的作用。

NF-κ B能調控免疫應答、炎癥反應、細胞分化和生長、細胞黏附和細胞凋亡所必需的許多細胞因子、黏附因子,它可以啟動和調節這些基因的轉錄,在機體的免疫應答、炎癥反應等方面發揮重要作用,因而推測NF-κ B在心肌炎后的左心室重構進程中可能存在重要作用。本實驗著重觀察了大鼠心肌炎后左心室重構、心功能及外周血中炎癥細胞因子水平的變化,并初步探究其機制是否部分通過NF-κ B來調控,從而為研究藥物的作用靶點及機制,延緩心肌炎向DCM轉化的疾病發展過程提供一定的依據。

1 材 料

7周齡SPF級雄性Lewis大鼠 28只,體質量130～170 g,購于北京維通利華實驗動物技術有限公司,實驗動物生產許可證號:SCXK(京)2002～0003。飼養在屏障系統中(溫度22～26℃,濕度50%～60%),自由飲用純凈水和食用標準合成的大鼠飼料。豬心肌球蛋白(編號:M-0531)、弗氏完全佐劑(編號:F-5881)、多聚賴氨酸、Ⅰ型、Ⅲ型膠原單克隆抗體購自Sigma公司;小牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司;HRP標記的羊抗鼠IgG購自華美生物工程公司;SABC免疫組化試劑盒(羊抗鼠)購自武漢博士德生物工程有限公司;細胞因子試劑盒購自美國RB公司;細胞及組織總蛋白抽提試劑、NF-κ B Pathway Activation試劑盒購自上海康成生物公司。550型酶標儀(Beckman),4℃離心機:SIGMA,核酸蛋白定量儀(德國Eppendorf),IBAS 2.5全自動圖像分析儀(德國Kontron),BX15型顯微鏡(日本Olympus),病理圖文分析系統(瑞醫RY-2000)。

2 方 法

2.1 模型制備與實驗分組

模型組(14只),參照文獻[2]方法,用豬心肌球蛋白免疫大鼠制備EAM模型;正常對照組(14只):于同時間同部位注射等體積生理鹽水。實驗直至結束,EAM模型組共存活了13只大鼠。

2.2 心臟結構和功能的評估

實驗第 70天應用超聲心動圖儀(型號:PHLIP Sequoia C256,探頭頻率:3～5 MHz)行心臟檢查。大鼠禁食12 h,禁飲2 h后,用氯氨酮50 mg/kg+安定5 mg/kg腹腔注射進行麻醉后測量左室舒張末期內徑(LVEDD)、左室收縮末期內徑(LVESD)、縮短分數(FS)、左室射血分數(LVEF);測量3個連續心動周期的圖像,取平均值。

2.3 左心室重量和左心室質量指數的評估

心臟由濾紙輕吸后沿房室環剪去心房及右心室游離壁稱量讀數即為左心室重量(LVW)(單位mg),左心室質量指數(LVMI)(單位mg/g)由左心室重量(mg)/大鼠體重(g)得出。

2.4 組織學鏡檢

稱重后將心臟分成心尖部,中間部和心底部三部分。中間部心肌做冰凍切片行Ⅰ型和Ⅲ型膠原檢查,心尖部分用液氮罐凍存。

2.5 血清中 TNF-α、IL-1、MCP-1 的檢測

血清中 TNF-α、IL-1、MCP-1的測定采用ELISA法。按照試劑盒說明書操作,酶標儀450 nm處測OD值,繪制標準曲線,計算樣品中TNF-α、IL-1、MCP-1 的濃度。

2.6 心肌組織NF-κ B活性測定

核蛋白提取方法如下:取液氮凍存心尖組織,4℃PBS溶液中解凍后稱重,每250 mg組織中加入1mL蛋白質抽提試劑(1 mL抽提試劑中加入5 μ L蛋白酶抑制劑混合液,5 μ L PMSF和5 μ L磷酸酶抑制劑混合液),勻漿器低速勻漿,4℃14 000 g離心15 min后收集上清,-80℃保存。樣品蛋白濃度采用核酸蛋白定量分析儀測定。采用ELISA法測定NF-κ B的活性,按照試劑盒說明書操作。

3 實驗結果

3.1 心臟結構和功能

如表1和圖1所示,與Control組相比,EAM組LVEDD、LVESD均明顯增加(P<0.01),LVEF明顯下降(P<0.01)、FS也下降(P<0.05)。

表1 心肌炎后大鼠心臟超聲參數的變化(n=27,±s)

表1 心肌炎后大鼠心臟超聲參數的變化(n=27,±s)

注:與正常對照組相比,＊P<0.05,#P<0.01

Group Control(n=14) EAM(n=13)LVESD(mm) 2.60±0.26 4.18±0.32#LVEDD(mm) 5.13±0.06 6.43±0.28#EF(%) 89.00±3.00 66.00±7.48#FS(%) 67.67±7.37 50.39±11.86＊

圖1 各組大鼠的彩超評估

3.2 左心室重構質量指數的評價

EAM組LVW相比于Control組明顯增加(P<0.01),而 EAM 組LVMI相比于Control組亦明顯增加(P<0.01)。見表2。

表2 各組左心室重量及左心室質量指數(即左心室重量/體重)的變化(n=27,±s)

表2 各組左心室重量及左心室質量指數(即左心室重量/體重)的變化(n=27,±s)

注:與正常對照組相比,#P<0.01。

Group Control(n=14) EAM(n=13)LVW(mg) 787.63±51.28 921.89±70.84#LVMI(mg/g) 1.80±0.10 2.27±0.12#

3.3 免疫組化法染色膠原纖維

圖2和圖3顯示:Control組心肌細胞間和血管周圍見少量棕黃色Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維;與Control組相比,EAM組Ⅰ、Ⅲ型膠原均呈明顯增生分布(P<0.01),其中Ⅰ型多于Ⅲ型,Ⅰ/Ⅲ比值均增加(P<0.01);見表3。

表3 心肌Ⅰ、Ⅲ型膠原面積(×104)及Ⅰ/Ⅲ比值的比較(±s,n=27)

表3 心肌Ⅰ、Ⅲ型膠原面積(×104)及Ⅰ/Ⅲ比值的比較(±s,n=27)

注:與正常對照組相比,#P<0.01。

Group Control(n=14) EAM(n=13)CollagenⅠ 3.45±1.61 25.80±2.02#CollagenⅢ 2.37±1.41 7.07±0.65#Ⅰ/Ⅲ 1.57±0.38 3.67±0.42#

3.4 外周血清中細胞因子濃度變化

與 Control相比,EAM 組 TNF-α、IL-1、MCP-1的濃度明顯升高(P<0.01),見表4。

表4 各組大鼠血清中細胞因子的水平(n=27,±s)

表4 各組大鼠血清中細胞因子的水平(n=27,±s)

注:與正常對照組相比,＊P<0.05,#P<0.01。

Group(pg/mL) Control(n=14) EAM(n=13)TNF-α 76.67±13.50 211.58±66.23#IL-1 81.20±49.09 821.88±326.08#MCP-1 103.55±24.55 207.17±75.37＊

圖2 大鼠心肌組織Ⅰ型膠原染色 200倍

3.5 各組心肌組織NF-κ B活性的變化

Control組心肌NF-κ B活性很低,EAM 組中活化的NF-κ B升高(P<0.01);見圖4。

4 討 論

圖3 大鼠心肌組織Ⅲ型膠原染色 200倍

圖4 大鼠心肌組織NF-κ B活性的變化

心肌炎和擴張型心肌病至今發病機制不清,大量國內外實驗研究均集中在急性期階段,認為抑制急性期相關指標能緩解癥狀延緩疾病進展;然而除重癥心肌炎或有明顯臨床癥狀的心肌炎患者外,部分心肌炎開始無特異癥狀,待臨床上發現時多已出現早期心臟結構、大小的改變或晚期心力衰竭的癥狀,所以研究心肌炎后的左心室重構是有臨床意義的。

實驗中觀察到EAM大鼠出現少動,倦怠,易激惹,足部陸續出現潰瘍,部分還出現踝關節腫脹;第28天血清中出現抗肌球蛋白抗體;第70天后發現EAM大鼠心臟呈灰白色,彈性差,心臟體積增大,LVW和LVMI增加,隨后的免疫組化染色顯示EAM大鼠心肌間質膠原纖維顯著增生,提示EAM大鼠發生了左心室重構。此時實驗中EAM大鼠外周血清中促炎細胞因子TNF-α、IL-1、MCP-1亦顯著增加。這是因為心肌特異性自身免疫反應的起始依賴于將抗原呈遞給T細胞以及DC的活化。在免疫反應中針對的抗原主要是心肌肌球蛋白[3],肌球蛋白釋放后,被抗原提呈細胞吞噬,在共刺激分子的輔助下,激活了針對心肌肌球蛋白的自身反應性T細胞,釋放炎癥細胞因子如 TNF-α[4-5]、IL-1 、IL-2 、MCP-1、INF-γ等共同促進心肌間質的抗原提呈細胞上調MHC分子的表達,增加了心肌肌球蛋白α重鏈表位的提呈能力,因而心臟固有淋巴細胞和浸潤淋巴細胞的活化以及局部細胞因子的釋放,形成了一個炎癥環境,導致免疫反應的起始和維持,自身反應性CD4+T細胞、CD8+T細胞和巨噬細胞被募集到心肌周圍及實驗免疫的部位,發揮致病效應;另外補體系統、粒細胞、樹狀突細胞、B細胞、肥大細胞的激活[6]和自身抗體的產生在心肌炎的進展過程中亦起一定作用。在實驗中TNF-α能降低左室功能,導致左室重塑及代謝消耗、微血管內凝血[7];MCP-1又可以造成 IL-1、IL-2、INF-γ、TNF-α等炎癥因子趨化聚集在炎癥周圍,加重炎癥反應,故而第70天彩超提示EAM組大鼠左心室擴大,心臟收縮力下降,這與Horii[8]和 Yuji Okura[9]的結果相符合;此外,心臟浸潤的免疫細胞及它們的產物,如活性氧簇、細胞因子、蛋白酶(包括基質金屬蛋白酶)、抗體等,損傷心肌細胞并導致細胞外基質改變。當調節機制失代償時,心肌間質細胞表型改變,成纖維細胞增殖,細胞外基質(ECM)成分分泌異常增多[10],局部損傷導致心肌細胞機能障礙和死亡、替代性纖維變性以及心功能障礙,從而一定程度上造成了心肌炎后心肌纖維化,心室重構的表現。既往的實驗表明TNF-α在該模型中至關重要,趙培等研究顯示在急性期TNF-α濃度極高[11],在本實驗中TNF-α雖較正常組明顯升高,但濃度較急性期是下降的,那么后期的病理改變除了TNF-α的重要作用外,可能還與IL-1相關,從結果中看到實驗結束時IL-1的濃度還較正常組高了10倍左右,并沒有因為后期急性炎癥的消退而明顯下降,由此看出后期心室重構與IL-1的持續引起心肌細胞肥大,細胞壞死和細胞凋亡,同時產生負性肌力作用造成心功能的下降有關;心肌炎癥產生的IL-1、TGF-β等能調控MMPS,誘導MMPs基因表達,使其活性升高,引發心肌膠原的降解[12],MMPs/TIMPs的平衡遭到破壞后,心肌膠原的合成增多,膠原的成分比例發生改變,Ⅰ型、Ⅲ型膠原增生,左心室重構形成。

由上看出心肌炎后左心室重構的過程十分復雜,不僅僅是抑制一種或幾種炎癥因子就能阻止其進展的,在這整個過程中,炎癥因子的合成、釋放必然要經歷一個由胞膜到胞漿,再由胞漿到胞核的信號傳導過程,最后必須再經過核內傳遞才能誘導相關炎性基因的表達,而NF-κ B正是此過程的核心[13-14]。實驗發現正常對照組心肌NF-κ B活性很低,EAM 組NF-κ B的活性要高于正常對照組,NF-κ B是一種活躍的轉錄因子,參與多種炎癥介質和細胞因子基因的表達調控,在靜息狀態下NF-κ B與其天然抑制因子Iκ B結合存在于胞質內,當細胞受到刺激后Iκ B被磷酸化,隨之被泛素化蛋白小體降解釋放NF-κ B進入胞核,NF-κ B結合與靶基因啟動子上的順式作用元件,從而促使基因表達形成并放大炎癥反應[15];故而實驗中NF-κ B可能刺激炎癥性細胞因子的分泌產生大量致炎癥細胞因子(IL-1、IL-6、IL-2、TGF-β、TNF-α等)、趨化因子(MCP-1)、粘附分子、急性期蛋白等,從而導致心肌的炎癥反應,由此實現NF-κ B激活,完成其作為一種核轉錄因子而調控基因轉錄的功能。所以實驗中看到即使在急性心肌炎后,NF-κ B的活性仍然高于正常對照組,NF-κ B的激活伴隨了心肌炎-心肌病的全過程,正是由于NF-κ B的激活導致了炎癥因子的大量釋放,造成了大鼠心肌炎癥反應,同時也影響了心肌間質的成分及結構的改變,從而促進了心肌炎后大鼠左心室重構的發生。劉東華等[16]通過病例對照分析,采用免疫組化等方法檢測到心力衰竭患者NF-κ B表達增高,細胞因子 TNF-α、IL-l、IL-6分泌增多;而Shioji等在急性期EAM 大鼠中用免疫組化法檢測心肌組織有NF-κ B的顯著表達,且其表達水平與心肌病變程度相關[17]。因而我們有理由推測心肌炎后的左心室重構至少部分與激活的NF-κ B可在轉錄水平上調控炎癥網絡分子的表達相關,抑制其激活可以抑制炎癥介質的合成和瀑布式級聯反應,從而可能阻斷病理效應,延緩左心室重構的發展。

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