小鼠CD8分子α鏈在SP2/0細胞中的表達及鑒定

錢 莉,潘興元,龔衛娟,季明春

(揚州大學醫學院,江蘇揚州,225001)

許多細胞因子如 IL-1、IL-15、TGF-β、TNF-α、M-CSF等,除了經典的可溶性形式以外,還以膜結合形式存在[1]。細胞因子的這兩種形式存在著功能上的差異。如膜結合型的IL-15比其可溶狀態具有更強的刺激NK細胞擴增的作用[2-3];膜結合型TNF-α通過效應細胞與靶細胞的直接接觸而發揮局部殺瘤效應,故毒副反應比可溶性TNF-α小,而且其殺瘤譜比可溶性 TNF-α廣。目前主要通過基因工程的方法構建膜型細胞因子:將細胞因子的成熟肽基因與跨膜分子的跨膜區和胞內區編碼基因連接,構成嵌合基因,使細胞因子由可溶性表達變為膜型表達[4]。常用的跨膜分子有 TNF、CD4和CD8分子等[5]。本研究主要運用基因工程的方法獲得CD8分子α鏈的重組表達載體,并將其表達在SP2/0細胞的表面,為進一步構建膜型細胞因子奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

TRizol購自美國Gibco BRL公司;細胞總RNA試劑盒、質粒抽提試劑盒、膠回收試劑盒均購自上海飛捷生物公司;引物由上海生工生物工程有限公司合成;dNTP購自MBI Fermentas;PrimeSTAR HS DNA Polymerase、T4 DNA 連接酶、限制性內切酶均購自日本 TaKaRa公司;抗CD8α磁珠購自德國Miltenyi Biotec;FITC和 PE標記的抗CD8α單抗以及同型對照抗體均購自美國BD Phar ming公司。

1.2 磁珠分選CD8α+T細胞及純度檢測

無菌分離獲取C57BL/6J小鼠的脾臟,用無菌針芯將脾臟磨碎,經孔徑為0.037 mm鋼網濾過并收集單細胞,Tris-NH4Cl裂解紅細胞,PBS洗滌2遍,用磁珠標記的抗小鼠CD8α單抗4℃標記15 min,PBS洗滌1遍,經磁式分選儀陽性分選CD8α+T細胞。取 2×105經磁珠分選的CD8α+T細胞,離心壓積,去上清?；靹蚣毎?大鼠血清封閉,4℃孵育10 min。加入PE標記的抗CD8α單抗,4 ℃孵育 15 min。PBS洗1次,流式細胞儀(FACSCalibur)檢測,實驗數據采用CellQuest軟件分析。

1.3 重組pVITRO/CD8α表達載體的構建

取磁珠分選得到的CD8α+T細胞,用trizol常規抽提RNA,以Oligo(dT)n為引物,反轉錄mRNA生成cDNA。用primer 5.0軟件設計擴增CD8α的引物,兩端分別加BamH I和Sal I的酶切位點及保護性堿基。上游引物序列為 5′-TCAGGATCCATGGCCTCACCGT TGACCC-3′,下游引物序列為 5′-ACTGTCGACT TACACAATTTTCTCTGAAGGTCT-3′。PCR 擴增程序為:98℃預變性2 min,98℃變性10 s,68℃退火和延伸1 min,共30個循環,最后再延伸7 min。PCR擴增產物經膠回收試劑盒純化后,用BamH I、Sal I雙酶切,與經同樣酶切處理的pVITRO載體按10∶1連接、轉化DH5α感受態菌株中,次日挑取菌落抽提質粒酶切鑒定正確后送公司測序。

1.4 pVIT RO/CD8α轉染 SP2/0 細胞

無菌條件下抽提pVIT RO/CD8α質粒。按照脂質體試劑盒說明書操作,具體過程為:取對數期的SP2/0細胞用無血清培養液洗2次,于24孔板中每孔加入5×105個細胞,每孔500 μ L體系,共10孔。取8 μ g的質粒用無血清的培養液稀釋至總量500 μ L,取20 μ L的脂質體用無血清培養液稀釋至總量500 μ L,兩者混合,微混勻,室溫孵育20 min,每孔加入100 μ L的復合物。37℃6 h后更換含10%小牛血清的RMI 1640培養基,48 h后棄上清,收集細胞用于檢測轉基因的表達。

1.5 流式細胞儀檢測CD8α的表達率

取pVITRO/CD8α質粒轉染的SP2/0細胞2×105,PBS洗滌。用PE標記的CD8α單抗4℃孵育15 min,PBS洗1次后,用流式細胞儀(FACSCalibur)檢測。

1.6 共聚焦顯微鏡檢測CD8α在SP2/0細胞中的定位

取pVITRO/CD8α質粒轉染的SP2/0細胞2×105,用FITC標記的CD8α單抗4℃孵育15 min,PBS洗滌,4%的多聚甲醛室溫固定20 min,用PBS洗 1遍,然后加 200 μ L的PBS 重懸細胞,按1∶1 000加Honest室溫5 min染核,再用PBS洗1遍,最后用10 μ L的PBS重懸細胞,點在玻片上,自然晾干,用封片劑(90%甘油,10%PBS,pH8.0)封片后置激光共聚焦顯微鏡下觀察。

2 結 果

2.1 流式細胞儀檢測磁珠分選的CD8α+T細胞的純度

經磁珠分選的CD8α+T細胞用PE-CD8α單抗標記后,顯示CD8α+T細胞的純度為97%(圖1),可用于下步提取總RNA。

圖1 流式細胞儀檢測磁珠分選的CD8α+T細胞純度

2.2 獲得CD8αcDNA 的PCR產物

經過CD8α+T細胞總 RNA的抽提,逆轉錄及PCR反應,獲得了CD8αcDNA的產物,片段大小為750 bp左右,與理論設計的核苷酸片段大小相符(圖2)。

圖2 CD8αcDNA 的PCR產物

2.3 重組載體的鑒定

pVITRO/CD8α的重組質粒經雙酶切鑒定后,顯示約6 300 bp和750 bp左右的片段(圖3)。對重組質粒插入序列進行測序分析,Genebank比對后顯示為CD8α的cDNA序列。結果表明,CD8α已成功地克隆入真核表達載體中。

圖 3 pVITRO/CD8α雙酶切結果

2.4 CD8α在SP2/0細胞的表達

轉染 pVITRO/CD8α的 SP2/0細胞經 PECD8α的單抗標記后用流式細胞儀檢測,顯示CD8α的表達率為61%(圖4)。結果表明,CD8α能在SP2/0細胞中成功表達。

2.5 共聚焦顯微鏡檢測CD8α在SP2/0細胞中的定位

轉染 pVITRO/CD8α的 SP2/0細胞經 FITCCD8α單抗標記后,置于共聚焦顯微鏡下觀察,結果顯示CD8α主要在SP2/0細胞的細胞膜上表達(圖5)。

圖4 流式細胞儀檢測CD8α在SP2/0細胞中的表達率

圖5 共聚焦顯微鏡檢測CD8α在SP2/0細胞中的定位

3 討 論

IKDC是最近發現的一類既與樹突狀細胞(dendritic cell,DC)相似又與NK細胞相似的多功能嵌合細胞[6-7]。兼具NK細胞和DC的功能:與NK細胞類似,可以產生IFN-γ并通過膜表面活化性受體NKG2D直接殺傷靶細胞;在CpG的刺激下,IKDC殺傷功能減弱,但MHCⅡ類分子和共刺激分子的表達增強,從而獲得了與DC類似的抗原提呈功能。IKDC能特異性的殺傷腫瘤細胞并且能交叉提呈腫瘤抗原,在腫瘤的免疫治療中具有良好的應用前景。但IKDC在小鼠體內的含量極少,只占脾臟CD11c+細胞的1%～2%(約5 000個)和骨髓CD11c+細胞的 2%[8],遠遠不能滿足過繼免疫治療所需的細胞數。目前體外用可溶性細胞因子IL-15刺激骨髓來源的DC可使IKDC得到一定的擴增,但擴增的效率比較低(僅能出現10～30倍的數量增長)[9-10]。已有的研究表明,IL-15處于細胞膜上比其可溶狀態能更有力刺激NK細胞的生長:可溶性IL-15刺激只能使NK細胞擴增數十倍,而如果將IL-15基因與跨膜蛋白CD8 α基因融合,使IL-15表達在K562細胞的表面(膜型IL-15),用該刺激細胞可使NK細胞得到大量的擴增。因此,對可溶性IL-15進行改造,使其變為膜表達型IL-15,很有可能達到體外高效擴增IKDC的目的。本研究成功構建了含CD8α全長基因的表達載體,并證實其在SP2/0細胞的細胞膜上能得到高效表達,為進一步構建IL-15基因與CD8α基因的嵌合體,獲得膜表達型的IL-15提供了依據。

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