均勻設計法優化柔紅霉素發酵培養基

潘淑勇

(魯南制藥集團股份有限公司，山東臨沂276006)

臨床上鹽酸柔紅霉素是治療急性非淋巴細胞性白血病的一線藥物，對兒童白血病也有良好的緩解作用，同時也是去甲氧柔紅霉素、阿霉素和表柔比星的合成起始原料。隨著人類癌癥發病率的逐年上升，鹽酸柔紅霉素的市場容量也在快速提高。2009年柔紅霉素、阿霉素和表柔比星均被收錄到《國家基本醫療保險藥品目錄》。然而較低的發酵效價造成了昂貴的生產成本，致使售價居高不下。降低生產成本，減少患者的負擔是我們當前迫切需要解決的問題。

1978年王元和方開泰提出了均勻設計，該設計考慮如何將設計點均勻地散布在試驗范圍內，使得能用較少的試驗點獲得最多的信息。多年來，均勻設計在國內得到了廣泛應用，并獲得不少好的成果。本次研究將采用均勻設計的方法，優化柔紅霉素的發酵培養基，以期進一步提高發酵效價，降低生產成本。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 親本:Dau G22:發酵效價為2 198 mg·L－1。保存于魯南制藥科研部。

1.1.2 培養基 種子搖瓶培養基:玉米淀粉4.0%，葡萄糖1.0%，麩皮1.0%，麩質粉0.5%，KH2PO40.1%，(NH4)2SO40.1%，CaCO30.4%，pH自然。裝60 mL于500 mL搖瓶中，121℃滅菌30 min。

發酵搖瓶培養基:玉米淀粉7.0%，麩皮1.0%，麩質粉0.5%，KH2PO40.1%，(NH4)2SO41.0%，CaCO30.8%;pH自然。裝30 mL于250 mL搖瓶中，121℃滅菌30 min。

1.1.3 色譜條件 高壓液相色譜Agilent C18色譜柱(53 mm ×7 mm，3 μm);流動相:15 mmol·L－1的磷酸二氫鉀－乙腈(1∶1);柱溫25℃;流速1.0 mL·min－1;檢測波長:254 nm。

1.2 方法

1.2.1 實驗方法 將Dau G22的工作細胞庫接入種子搖瓶，接種量1 mL，于29℃搖床中220 rpm培養42 h。再轉接到發酵搖瓶培養基中，接種量10%，每個菌株接種3個搖瓶，于28℃搖床中220 rpm培養168 h。高壓液相測定效價。

1.2.2 實驗設計 發酵搖瓶培養基設計采用均勻設計表U*10(108)，S=3，D=0.168 1，見表1［1］。

表1 ，S=3

表1 ，S=3

1 5 6 1 1 5 7 2 10 3 3 3 4 10 2 4 4 9 6 5 5 3 2 6 6 8 9 7 7 2 5 8 8 7 1 9 9 1 8 10 10 6 4

將發酵搖瓶培養基的玉米淀粉、麩皮、麩質粉3種成分作為3個因素進行10水平的實驗，各因素水平分布見表2。

表2 各因素水平分布

1.2.3 數據分析 計算平均效價，數據分析使用SAS 9.0軟件，做二次曲面回歸，得出最佳配方。

1.2.4 驗證 將分析得到的配方用搖瓶發酵進行驗證。

2 結果與分析

2.1 搖瓶發酵實驗結果 實驗結果見表3。

2.2 數據分析 使用SAS軟件做二次曲面回歸得到回歸方程:Y=－6 396.5+1 977.1［玉米淀粉］+5 559.6［麩皮］－8 560.7［麩質粉］+6.3［玉米淀粉］2－1 670.6［玉米淀粉］×［麩皮］－217.7［玉米淀粉］×［麩質粉］+10 355［麩皮］×［麩質粉］

顯著性影響見表4。

表3 搖瓶發醇實驗結果

表4 3個因素的F值和P值

P值均 ＜0.5，因此3個因素對發酵效價均有顯著影響。

SAS預測當［玉米淀粉］=12.4%，［麩皮］=1.1%，［麩質粉］=1.5%時發酵效價達到最大為:2 606 mg·L－1

2.3 發酵效價的驗證 根據分析結果，使用如下培養基再次發酵驗證預測準確性:玉米淀粉12.4%，麩皮1.1%，麩質粉1.5%，KH2PO40.1%，(NH4)2SO41.0%，CaCO30.8%; pH自然。實驗方法同上所述。

驗證實驗結果見表5。

表5 優化后培養基搖瓶發酵效價

驗證實驗最高發酵效價為2 703 mg·L－1，比原培養基發酵效價提高23%，SAS預測結果較為準確。

3 小結

均勻設計是我國科學家自主發明的一種優秀的設計方法，在我國的火箭等尖端科學研究中發揮了重要的作用，我們應用均勻設計實現了柔紅霉素發酵培養基的改良，為進一步降低生產成本，提高市場競爭力，降低患者負擔發揮了一定的作用。

［1］ 峁詩松，王靜龍，史定華.統計手冊［M］.北京:科學出版社，2003:751.