食品動物細胞色素P450的研究進展

劉兆穎，伍 勇(綜述)，孫志良(審校)

(湖南農業大學動物醫學院湖南省獸藥工程技術研究中心，長沙410128)

細胞色素P450酶(cytochrome P450，CYP)是一復雜的多酶體系，CYP多肽鏈的分子量因動物種屬不同而異。CYP酶系的特異性及底物重疊性，大部分是由于存在大量CYP同工酶，這些酶的氨基酸序列具有高度同源性，可歸于同源蛋白質。食品動物CYP是指參與食品動物(豬、牛、羊、雞、魚等)機體內各種外源物質，如獸藥、飼料添加劑、環境污染物等異物代謝轉化的P450酶系的總稱。研究食品動物細胞色素P450，有利于指導獸醫臨床合理用藥，避免中毒和藥物的相互作用;指導新獸藥設計與劑型改進;也有利于指導殘留分析和殘留監控，保障食品安全和消費者的健康。因此，食品動物中CYP的研究越來越受到國內外的重視。目前，研究人和實驗動物CYP的報道較多，而研究食品動物中CYP相對很少，且大部分研究只證明了CYP在食品動物中的表達和活性，而與獸藥的聯系不緊密。在此將國內外有關食品動物中細胞色素P450酶的影響因素，幾種細胞色素P450同工酶在食品動物中的表達和活性等方面的研究進展予以綜述，為獸藥的CYP進一步研究提供重要的基礎。

1 CYP1A

CYP1A除參與有機環境污染物的生物轉化外，一些獸藥也可經該酶代謝，如阿苯噠唑、噻苯噠唑、甲苯噠唑、咖啡因和雌二醇，CYP1A能活化一些多環芳香烴和聚氯聯(二)苯等前致癌物。豬體內CYP1A同工酶雖然證實它可被β-萘黃酮或多氯聯苯所誘導，但目前尚未進行測序研究［1，2］Western雜交發現豬、牛和羊的CYP1A與人的CYP1A2抗體無交叉反應，但與抗鼠CYP1A1/2 IgG有很強的交叉反應［3］。豬的 CYP1A蛋白與抗兔CYP1A1/2有較弱的交叉反應［4］。用 CYP1A的特征底物和Western雜交發現:牛肝中的 CYP1A活性很高，與綿抗大鼠CYP1A1存在很高的交叉反應，并推測牛中可能存在兩種CYP1A同工酶［5］。CYP1A亞家族可被植物中的許多營養素所誘導［6］，因此，牛中高表達的CYP1A可能與此有關。目前，從雞胚肝中純化和確定了四氧二苯二氧雜環己二烯誘導的兩個CYP，一個命名為CYP1A4，具有乙氧-9-羥基異吩噻唑-O-脫乙基酶和芳香烴羥化酶的活性;另一個命名為CYP1A5，具有四氧二苯二氧雜環己二烯誘導的花生四烯酸的環氧化和他莫昔芬的4-羥化，但沒有乙氧-9-羥基異吩噻唑-O-脫乙基酶和芳香烴羥化酶的活性［7-8］。并對雞的CYP1A進行了克隆和表達［9］。魚的CYP1A基因可作為評價水生環境污染的生物標志物，但是，魚的CYP1A在不同品種之間的序列相似性不高CYP1A抗體在不同魚物種間的交叉反應很低。目前，從雌雄同體魚中克隆了CYP1A的cDNA序列，并在大腸埃希菌中重組表達成功［10］。

2 CYP2A

目前，從豬肝微粒體中分離、純化了CYP2A，并用免疫染色分析N-末端的20個氨基酸序列，發現有14個氨基酸與人的CYP2A6相同(70%)［11］。并且研究發現豬個體之間存在很大的CYP2A代謝差異引起這差異的原因并不是豬中存在CYP2A多態性而是由于轉錄調控［12］，該基因在小豬中有1620 bp和1795 bp兩條 cDNAs(GenBank accession number AY380866)，長的或野生型cDNA與豬CYP2A19序列同源(GenBank accession number AB052255)，該基因編碼的蛋白有99%與CYP2A19一致，即494個氨基酸中有493個是一樣的;短的cDNA與普通豬CYP2A19序列相似，該基因編碼487個氨基酸，前面466個中有464個與普通豬CYP2A19一樣，409個與人的CYP2A6，其他的氨基酸都不同。普通豬和小豬的野生型CYP2A包含6個底物識別位點，而短的CYP2A只有前5個底物識別位點。

3 CYP2C

從豬的小腸cDNA文庫中轉錄了CYP2C42基因，該基因是由327個氨基酸編碼的開放讀碼框架，并不是全長的克隆。Zaphiropoulos等［4］用反轉錄-聚合酶鏈反應方法從排卵前的濾泡中得到了5條cDNA克隆，以cDNA為模板擴增，得到5個DNA雙鏈，分別命名為CYP2C32、CYP2C33、CYP2C34、CYP2C35、CYP2C36。從豬肝微粒體中分離、純化了CYP2C，并用免疫染色分析N-末端的20個氨基酸序列，發現有10個氨基酸與人的CYP2C9相同(50%)［11］。Baader等［13］克隆了雞的第一個CYP2C亞家族cDNA，命名為CYP2C45，在發現該基因前，認為雞中CYP2H1是CYP2C的類似物，苯巴比妥能誘導CYP2C45 mRNA增加，誘導的機制與CYP2H1基因的一個264 bp苯巴比妥反應增強單位相似［14］，即在2.6 kb片段中有一個CYP2H1苯巴比妥反應增強單位的核因子1位點和同向重復核受體結合位點。

4 CYP2D

牛的CYP2D蛋白已克隆，與人的CYP2D6相比，核苷酸序列只有不到7%的差別。目前，從豬的小腸cDNA文庫中已轉錄了CYP2D25基因［15］，在豬的肝微粒體中也分離了CYP2D25，該蛋白77%以上的序列與人的CYP2D6相同，并催化一些共同的底物，如普萘洛爾、丁呋洛爾、右美沙芬和托特羅定［2］。而人的CYP2D6不能催化維生素D的25-羥化［16］。Sakuma等［15］總結了不同種屬的 CYP2D同工酶與人的CYP2D6核苷酸和氨基酸序列的一致性(表1)。

5 CYP2E

CYP2E1主要參與一些低分子質量異物的代謝活化。小豬的CYP2E1已經分離純化、cDNA克隆和測序，豬和小豬的CYP2E1由496個氨基酸組成，比人的少兩個殘基。豬和小豬的CYP2E1結構上只有細微的差別，即第346位的氨基酸不同，豬的是纈氨酸，小豬的是天冬氨酸，而人的是谷氨酸，這樣，小豬的CYP2E1跟人的更相似［17］。CYP2E1的結構是CYP中最保守的酶之一，在不同種屬之間，將近80%的氨基酸序列是一致的［16］，因此，許多動物都有相似的催化特征。豬與人的CYP2E1結構上的主要區別是底物識別［18］，豬在該區域的兩個氨基酸是His92和Asn95，而人的都是天冬氨酸。

表1 其他動物CYP2D同工酶與人CYP2D6核苷酸和氨基酸序列的比較

6 CYP3A

CYP3A是異物代謝中最重要的CYP，參與的底物相當廣泛。Western雜交發現豬、牛和羊的CYP3A蛋白與抗人的CYP3A4 IgG有較強的交叉反應，但與抗鼠CYP3A1 IgG的交叉反應較弱。在V79中國倉鼠細胞中表達了牛的全長CYP3A cDNA序列，該蛋白能使睪酮包括6β在內的許多位置的羥化，也能被CYP3A抑制劑酮康唑所抑制［19］。van't Klooster等［20］用抗鼠CYP3A1的單克隆抗體檢測到牛后線粒體液一條免疫反應蛋白。并有研究者從綿羊中純化了CYP3A蛋白，該蛋白能被醋竹桃霉素誘導，催化紅霉素、氯丙嗪、氯苯那敏和溴己新的 N-脫甲基化［21］。目前，從豬的小腸 cDNA文庫中已轉錄了CYP3A29基因，從豬肝微粒體中分離、純化了CYP3A29，并用免疫染色分析N-末端的20個氨基酸序列，發現有12個氨基酸與人的 CYP3A4相同(60%)。不同種屬的CYP3A同工酶與人的CYP3A4核苷酸和氨基酸序列的比較見表2。

7 CYP4A

CYP4A包含許多同工酶，主要催化各種脂肪酸的ω和ω-1氧化，包括月桂酸、花生四烯酸和前列腺素［22］。比較豬、牛、山羊和綿羊肝微粒體的12-月桂酸羥化酶的活性，發現羊肝中的12-月桂酸羥化酶的活性很高。豬的CYP4A21在底物特異性和結構特征上與其他的CYP4A不同，它是CYP4A中唯一催化脫氧鵝膽酸的 6α-羥化，參與膽汁酸的合成CYP4A21有 95% 的基因序列與 CYP4A24和CYP4A25相同，大小約13 kb，有12個外顯子，并且研究表明豬的CYP4A21和CYP4A24的基因都是從一個遺傳基因復制而來，其5'末端高度一致，主要不同的是6～8外顯子之間的核苷酸序列［23］。

表2 其他動物CYP3A同工酶與人CYP3A4核苷酸和氨基酸序列的比較

8 展望

目前對食品動物細胞色素P450酶的研究還只停留在代謝酶序列種屬差異比較、活性及含量測定等常規研究上，而對CYP參與獸藥代謝，CYP作用的分子機制、表達調控及結構與功能的關系及翻譯后修飾等領域的研究有待進一步深入。隨著生物學、分子生物學、醫藥學、畜牧業及分子藥理學、藥效學、毒理學等相關學科的發展和新儀器新技術的出現，先進實驗技術和檢測技術也在不斷地增加，藥物代謝酶及相關學科領域必將有廣闊的發展前景。目前，細胞色素P450等代謝酶的分子生物學研究已深入到基因表達的調控，使對酶的結構進行剪裁從而改變其活性進而改變藥物的代謝過程，并應用于藥物代謝研究領域成為可能。同時由于蛋白質組學及其他新技術的發展，CYP基因的調控機制及CYP結構和功能關系，脂溶性CYP晶體結構模擬將成為今后獸藥代謝酶的研究熱點。

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