天麻素后處理對(duì)糖氧剝奪大鼠皮層神經(jīng)元EphA 4表達(dá)的影響

方 莉 付振強(qiáng) 張博愛(ài)(通訊作者)

1)鄭州大學(xué)醫(yī)院檢驗(yàn)科 鄭州 450001 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450052

天麻素后處理對(duì)糖氧剝奪大鼠皮層神經(jīng)元EphA 4表達(dá)的影響

方 莉1)付振強(qiáng)2)張博愛(ài)2)(通訊作者)

1)鄭州大學(xué)醫(yī)院檢驗(yàn)科 鄭州 450001 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450052

目的研究天麻素對(duì)糖氧剝奪(oxygen-g lucose dep rivation,OGD)大鼠皮層神經(jīng)元損傷的保護(hù)性作用及EphA4表達(dá)的影響。方法提取新生大鼠大腦皮層神經(jīng)元體外培養(yǎng)7 d,對(duì)4組神經(jīng)元分別施以60m in的OGD,換回正常培養(yǎng)液培養(yǎng)30m in后分別及給予含終濃度為50、125、250、500μmol/L天麻素的培養(yǎng)液作為后處理措施,培養(yǎng)4 h后換回正常條件培養(yǎng)24 h;采用倒置相差顯微鏡觀察神經(jīng)元形態(tài)學(xué)變化,LDH活性測(cè)定檢測(cè)神經(jīng)元損傷情況,CY3熒光染色檢測(cè)EphA 4表達(dá)變化。結(jié)果天麻素后處理能降低糖氧剝奪神經(jīng)元的損傷,降低EphA4表達(dá)。結(jié)論天麻素對(duì)糖氧剝奪神經(jīng)元損傷有保護(hù)作用,該作用與EphA4表達(dá)降低有關(guān)。

book=26,ebook=130

天麻素;神經(jīng)元;糖氧剝奪;EphA4

天麻素(Gastrodin)是中藥天麻的主要有效成分,具有促進(jìn)受損腦組織的恢復(fù)、鎮(zhèn)靜、安神、緩解神經(jīng)性頭痛等作用[1]。研究顯示天麻素在神經(jīng)損傷時(shí)對(duì)多個(gè)環(huán)節(jié)有保護(hù)性作用,比如穩(wěn)定細(xì)胞膜、抗氧化、抗凋亡和抗興奮毒性[2],臨床上已用于治療腦功能損傷、失眠、神經(jīng)衰弱及神經(jīng)性頭痛等。人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系A(chǔ)4(ery thropoietin p roducing human hepatocellu lar carcinoma cell line A 4,EphA4)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后由促紅細(xì)胞生成素生成,在受損側(cè)腦海馬神經(jīng)元和脊髓軸突表達(dá)上調(diào),具有許多重要的保護(hù)作用如參與軸突生長(zhǎng)、突觸重塑、調(diào)控神經(jīng)元存活等[3]。本實(shí)驗(yàn)用 OGD制作神經(jīng)元缺血缺氧模型,觀察天麻素后處理對(duì)其影響,并探討E-phA4在該過(guò)程中的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑 健康新生SD大鼠(SPF級(jí))60只,雌雄不限,購(gòu)自鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。Neurobasal培養(yǎng)基、B27和胎牛血清(購(gòu)自 Gibco公司),胰蛋白酶、多聚賴氨酸、天麻素、3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(M TT)(購(gòu)自Sigma公司),乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)定量檢測(cè)試劑盒(購(gòu)自南京建成生物工程研究所),抗鼠EphA4多克隆抗體(購(gòu)自Santa Cruz公司),CY3熒光試劑盒(購(gòu)自武漢博士德生物制品公司),其余試劑均為進(jìn)口分裝。

1.2 原代培養(yǎng)新生大鼠皮層神經(jīng)元 用75%酒精消毒新生SD大鼠(出生24 h以內(nèi)),嚴(yán)格無(wú)菌條件下斷頭,將雙側(cè)大腦皮層取出置于培養(yǎng)皿內(nèi),PBS反復(fù)漂洗,解剖顯微鏡下剝離血管及腦膜。轉(zhuǎn)移腦組織至裝有0.25%胰蛋白酶的培養(yǎng)皿,用眼科剪剪成約1 mm×1mm×1 mm的小塊,37℃水浴消化30 m in,每隔5 m in晃動(dòng)一次以加快消化速度。然后加入等體積的含有胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化,移入無(wú)菌離心管用吸管吹打均勻,1000 rpm/m in離心10 m in,棄上清,加入培養(yǎng)基(Neurobal培養(yǎng)基500m L+B27 10m L+L-谷氨酰胺1 mmol,pH值7.20)吹打使細(xì)胞重懸,200目篩網(wǎng)過(guò)濾,細(xì)胞計(jì)數(shù)并調(diào)整密度為(1～3)×106/cm3,接種到預(yù)先用0.01%多聚左旋賴氨酸包被的24孔培養(yǎng)板。置于5%CO2培養(yǎng)箱中,37℃培養(yǎng)24 h后第一次換液,以后每三天換一次液,培養(yǎng)7 d制作氧糖剝奪模型。

1.3 氧糖剝奪模型OGD制備[4]及分組 OGD模型制備方法：神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)到7d,更換培養(yǎng)基為無(wú)糖Earle's平衡鹽溶液 (mmol/L,pH 7.2-7.4：NaCl 116,KCl 5.4,MgSO40.8,NaH2PO41.0,CaCl21.8,NaHCO326),將細(xì)胞培養(yǎng)板移入潮濕密閉容器,37℃恒溫30 min,連續(xù)充以5%CO2+95%N2(體積比)的混合氣體。Earle's液預(yù)先通上述混合氣體平衡30 m in。細(xì)胞分組：原代神經(jīng)元培養(yǎng)7d后隨機(jī)分5組,每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔,各組均施以60 m in的OGD后各組分別給予天麻素濃度為0 mg/L,12.5 mg/L,25 mg/L,50 mg/L,100mg/L的培養(yǎng)基,其中第1組為對(duì)照組。4h后換回正常培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h測(cè)定相應(yīng)指標(biāo)。

1.4 LDH活性測(cè)定 取處理后繼續(xù)培養(yǎng)24h的培養(yǎng)基上清置于1.5 m L EP管中,每管0.3 m L,3000 rpm/m in離心10 min,按試劑盒說(shuō)明書測(cè)定LDH。

1.5 細(xì)胞熒光化學(xué)法檢測(cè)EphA4蛋白表達(dá) 各組神經(jīng)元換回原培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后用4%多聚甲醛固定30 min,含5%牛血清白蛋白的TBST(g/L,Tris堿2.42,NaCl8,Triton X-100 1,pH 7.6)封閉60 m in;1∶100兔抗鼠EphA4抗體,4℃過(guò)夜;1∶200 CY3標(biāo)記的抗兔 IgG作用 60 m in;抗熒光淬滅封片液封片后熒光顯微鏡下觀察,免疫陽(yáng)性細(xì)胞呈現(xiàn)紅色熒光。以Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件分析各實(shí)驗(yàn)組的熒光圖片單個(gè)細(xì)胞的累積光密度值(integrated op tical density,IOD)和平均累積光密度值,進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)處理分析用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的各組數(shù)值經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)后,采用單因素方差分析(ANOVA),組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P＜0.01為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察 倒置相差顯微鏡下觀察,培養(yǎng)7d的神經(jīng)元形態(tài)成光滑的橢圓形或錐形,大小均勻一致,胞體飽滿,突起廣泛交叉成網(wǎng)狀,折光性強(qiáng);OGD組神經(jīng)元折光性下降,胞體出現(xiàn)顆粒,軸突出現(xiàn)串珠,形狀僵硬,突起縮短,分支減少。各濃度天麻素神經(jīng)元形態(tài)較OGD組有不同程度的改善,以天麻素濃度為25mg/L組改善最明顯。見(jiàn)圖1。

2.2 天麻素對(duì)OGD神經(jīng)元LDH活性的影響 與僅施以O(shè)GD的神經(jīng)元比較,各天麻素組神經(jīng)元均有不同程度的降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,以天麻素濃度為25 mg/L組差異最為顯著(P＜0.01)。見(jiàn)圖2。

2.3 天麻素對(duì)OGD神經(jīng)元EphA 4蛋白表達(dá)的影響 倒置熒光顯微鏡觀察,EphA4免疫陽(yáng)性神經(jīng)元胞體、突起均呈紅色熒光,但熒光強(qiáng)度不同。與僅施以O(shè)GD的神經(jīng)元平均IOD值比較,各天麻素組神經(jīng)元有不同程度的降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,以天麻素濃度為25 mg/L組差異最為顯著(P＜0.01)。見(jiàn)圖3。

3 討論

我國(guó)缺血性腦卒中發(fā)病率為120/10萬(wàn)～180/10萬(wàn),死亡率為60/10萬(wàn)～120/10萬(wàn),病后存活患者中,殘廢率高達(dá)75%,其神經(jīng)細(xì)胞死亡導(dǎo)致的神經(jīng)功能缺損對(duì)患者的生活質(zhì)量造成嚴(yán)重影響。

天麻素為蘭科天麻屬植物天麻Gastrodia elata Blume塊莖的提取物,是其有效成分之一,其化學(xué)結(jié)構(gòu)為4-羥甲基苯β-D-吡喃葡萄糖甙。進(jìn)入體內(nèi)后先被分解成天麻甙元(對(duì)羥基苯甲醇),通過(guò)血腦屏障,發(fā)揮效應(yīng)[1,5]。天麻素通過(guò)對(duì)抗

圖1 各組神經(jīng)元光鏡照片(×200)

圖2 不同濃度天麻素對(duì)OGD后神經(jīng)元LDH釋放的影響

圖3 不同濃度天麻素對(duì)OGD后神經(jīng)元EphA4表達(dá)的影響

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(收稿2011-01-12)