探針熔解分析法快速檢測結核分枝桿菌鏈霉素耐藥突變＊

張向東,張 婷,牛建軍,溫慧欣,胡思玉,李慶閣

20世紀80年代后期,由于貧困、艾滋病、人口流動和耐藥等因素,結核病發病率和死亡率在全球范圍內出現快速回升,成為與艾滋病并列的全球性危害最嚴重的傳染病。結核分枝桿菌耐藥情況嚴重,耐藥率高達46%,給結核病的預防和治療帶來嚴峻挑戰[1-3]。

抗結核藥物是結核病化學治療的基礎,而結核病的化學治療是人類控制結核病的主要手段。鏈霉素發現于20世紀40年代,是最早出現的有效抗結核藥物[4],也是治療結核病的一線藥物之一。鏈霉素是一種氨基環醇糖苷類抗生素,主要作用于結核分枝桿菌的核糖體,與結核分枝桿菌的核糖體30S亞單位結合,誘導遺傳密碼的錯配,抑制mRNA翻譯的開始,干擾翻譯過程中的校對,從而抑制蛋白質的合成[5]。鏈霉素經常單獨給藥,因此其耐藥性發展較快。結核分枝桿菌耐鏈霉素的主要分子機制是編碼小亞基的S12蛋白的rpsL基因和編碼16S核糖體RNA的rrs基因突變,從而抑制藥物結合核糖體的能力,造成對鏈霉素耐藥[6]。

結核分枝桿菌鏈霉素耐藥性的檢測對于控制耐藥性結核分枝桿菌的傳播以及控制結核病有極其重要的意義。目前臨床上采用的耐藥檢測方法可分為表型檢測和基因型檢測兩類[7-8],并以前者為主。然而表型檢測因為各種原因,如耗時、設備昂貴、有放射性危害或干擾因素多等,難以形成快速高效的篩查手段。相對而言,基因檢測更為直接,目前已經使用的基因分析方法有單鏈構象多態性分析法(SSCP),限制性片段長度多態性分析法(RFLP),DNA測序法,線性探針雜交法,RNA/RNA錯配分析法,以及DNA陣列(芯片)檢測等[9-10]。這些方法雖然檢出率和通量高低不同,但共同缺點是需要進行PCR后處理,不僅影響了檢測效率,易引起擴增產物污染,而且增加了操作難度,提高了對實驗室的要求。

實時PCR技術將擴增和檢測兩步驟合一,具有快速、特異、靈敏、定量等優點,已在病原微生物檢測和突變檢測領域得到廣泛應用,近年來在結核菌耐藥檢測上的應用也引起人們極大興趣[11-13]。本研究利用廈門致善生物科技有限公司的結核分枝桿菌鏈霉素耐藥突變實時PCR檢測試劑盒(探針熔解分析法)對結核分枝桿菌基因組中鏈霉素耐藥相關突變位點進行檢測。

1 材料與方法

1.1 菌株來源及處理

1.1.1 菌株來源

1.1.1.1 臨床分離株 從2006年6月至2009年12月分別從廈門市疾病預防控制中心、廈門市第一醫院、漳州市疾病預防控制中心收集,合計906份。將收集的結核分枝桿菌臨床分離株采用酸性改良羅氏培養基及Biomerieux BacT/AL ERT 3D 60培養系統進行分離和培養。

1.1.1.2 野生型標本 結核分枝桿菌 H37RV標準株來源于國家結核病參比實驗室。

1.1.1.3 標準菌株盤 特異性實驗所用的包含37株非結核分枝桿菌的標準盤,由中國藥品生物制品檢定所提供。

1.1.2 菌株處理 PCR擴增模板用試劑盒提供的提取液制備。具體如下:固體培養基上生長的結核分枝桿菌,用接種環收集細菌并懸于300μL提取液中。液體培養基中生長的結核分枝桿菌取1mL,10 000r/min離心15min,丟棄上清并在300μL提取液中重懸細菌。封口膜封口,99℃加熱20min,然后14 000r/min離心10min,轉移上清到新1.5 mL離心管。上清即為PCR擴增模板,模板濃度經紫外定量,要求結核桿菌含量不低于103拷貝/μL。使用前保存于-20℃。

1.2 實驗儀器 用 T3 Thermocycler(Biometra,Germany)普通 PCR儀和 Bio-Rad CFX96(Bio-Rad,USA)實時PCR儀檢測。

1.3 試劑盒評價 結核分枝桿菌鏈霉素耐藥突變實時PCR檢測試劑盒(探針熔解分析法)由廈門致善生物科技有限公司提供。該試劑盒采用探針熔解分析法檢測rpsL和rrs基因突變,試劑盒包括提取體系(細菌DNA提取液)、擴增體系(PCR反應混合液和酶)和對照體系(陽性對照品和陰性對照品)。檢測流程包括PCR擴增和熔解分析兩步驟,可以單獨在實時 PCR儀器上一步完成,也可以先在普通PCR儀上進行擴增,再移至實時 PCR上進行熔解分析。反應程序為95℃5min;95℃10s,70℃20s(每個循環下降 1℃),75℃20s,循環 10次;95℃10s,60℃20s(檢測熒光),75℃20s,循環30次,熒光通道選用 FAM和 TET;熔解分析程序:40～80℃,每度進行FAM和 TET熒光采集。其檢測原理是野生型基因具有特定的熔點,基因突變導致探針結合能力下降,熔點會下降3～10℃不等,根據熔點變化即可判斷突變的有無。

鏈霉素耐藥突變檢測分兩管在雙色實時PCR儀器進行。一管檢測rpsL43、rpsL88密碼子基因突變,另一管檢測rrs513～517位點和rrs905～908位點基因突變,PCR體系按照試劑盒說明書配制,25μL檢測體系含 20μL PCR反應液和 5μL模板DNA。

1.3.1 特異性考察 用中國藥品生物制品檢定所提供的37株非結核分枝桿菌考察該試劑盒的分析特異性。

1.3.2 靈敏度考察 將純化的標準株基因組DNA以10倍梯度從105拷貝/μL稀釋到100拷貝/μL作為擴增模板,考察該試劑盒的分析靈敏度。

1.4 標本檢測 將不同來源的906株結核患者臨床分離株用該試劑盒進行檢測,所有檢測為突變的標本、疑似為雜合的標本、與藥敏結果不符的標本均測序驗證。測序由北京六合華大基因科技股份有限公司完成。

2 結 果

2.1 體系分析特異性考察 經驗證,37份非結核分枝桿菌中只有1份非結核分枝桿菌在rrs513環區有非特異信號,為胃分枝桿菌,但在其它3個位點均無信號,故不影響檢測,如圖1。

圖1 試劑盒分析特異性考察圖中陽性對照及空白對照用實線表示,37株非結核分枝桿菌用虛線表示Fig.1 Results of the analytical specificity testThe solid line represented wild type control and nontemplate control,while the dashed line represented 37 standard non tuberculosis mycobacterium strains

2.2 體系分析靈敏度考察 經驗證,該試劑盒可以檢測出5～50copies H37Rv每反應,且各濃度梯度的Tm值均一性良好。

2.3 標本檢測結果 共檢測了906份結核分枝桿菌培養標本,其中103份標本發生突變,突變比例為11.37%,有18份標本存在雜合信號,17份標本存在不同程度的無信號現象。實時檢測結果具體總結如表1。

在4個檢測區域中,rpsL43位點的突變率最高,占到突變總數的77.67%;rrs513區域和rpsL88位點突變率次之,rrs905區域的突變率最低,占突變總數比例分別為10.68%、10.68%和0.97%。所得結果與文獻中所報道的相符[14-15]。

18份存在雜合信號的標本在實時結果中體現為在野生峰的左側突變位置有小峰,或者野生峰的左側往上偏,甚至峰值偏低1℃左右。出現這幾種情況的峰型后,將該標本出現雜合信號的相應區域進行測序驗證,雜合測序結果如圖2。

17份標本在不同區域的實時結果沒有信號,且均做過重復實驗,具體原因可能為:1)標本中不存在結核分枝桿菌基因組DNA,從而無法擴增得到目的片段;2)標本中存在較高濃度的抑制劑,產生的目的片段量大大減少甚至完全沒有;3)人為操作誤差或儀器誤差等。

2.4 測序驗證 103份突變標本的測序結果與使用結核分枝桿菌鏈霉素耐藥突變檢測試劑盒所得結果符合率為100%。具體測序結果及其對應Tm值如表 2。另外,rpsL43、rpsL88、rrs513和rrs905 4個位點的野生Tm值分別為 59℃、67℃、65℃和62℃。表中比率為該種突變類型占突變總數的百分比。

表1 結核分枝桿菌臨床分離株探針熔解分析法檢測結果Table 1 Results ofMycobacterium tuberculosisclinical isolates by using PMA

18份雜合標本的測序結果中,4份標本為雜合,如圖2,rpsL43位點野生型序列為AAG,同時不同程度雜合了rpsL43位點序列為AGG的擴增產物,說明在野生型菌株DNA模板中存在突變為AGG的菌株DNA模板。11份標本測序只得到純合結果,可能是因為測序的檢測靈敏度低于此檢測體系的靈敏度,從而無法得到雜合結果。2份標本在探針覆蓋區均為野生序列,但是在探針左邊非覆蓋區的第一個堿基由C突變為 T,此即為熔解峰異常的原因,但之前文獻中并未報道過此位點與鏈霉素耐藥的相關性,并且這3份標本均無藥敏結果,因此無法判斷這3份標本耐藥與否。在鏈霉素耐藥相關位點,用此檢測體系得到的結果與測序結果的一致性達到100%。

表2 突變標本測序結果Table 2 Sequencing results of mutant isolates

圖2 4份雜合標本測序結果Fig.2 Sequencing results of the four heterozygous isolates

2.5 藥敏結果對照 在上述908份標本中,37份標本有藥物敏感試驗結果,具體對照情況如表3。在這37份標本中,實時檢測為突變的藥敏結果均為耐藥,但有9份標本實時檢測為野生而藥敏結果也為耐藥。這種情況是可能出現的,因為在鏈霉素耐藥菌株中,只有75%左右的菌株會發生基因突變,約25%的菌株基因型為野生,一方面可能是在目前報道的鏈霉素相關突變位點之外的區域存在未被發現的突變;另一方面可能并不是基因突變而導致耐藥,而可能與細胞膜的通透性有關[16-17]。由于目前只檢測了37份有藥敏結果的標本,藥敏結果為耐藥的標本只有16份,因此突變檢出率并不能真正反應此檢測方法的臨床靈敏度。

為更好地評價探針熔解分析法,將37份有藥敏結果的標本均進行測序驗證。4個檢測區域采用3個片段進行測序:rpsL43和rpsL88使用一對測序引物擴增并測序,rrs512采用一對測序引物擴增并測序,rrs905采用一對測序引物擴增并測序。具體測序結果如表4。

表3 實時結果與藥敏結果對照(份)Table 3 Comparison of drug susceptibility results

表4 有藥敏結果的37份標本測序結果Table 4 Sequencing results of 37 samples

用探針熔解分析法檢測出的7份突變標本測序均為突變,與藥敏結果一致。其中,rpsL43位點4份突變標本均由AAG突變為AGG,rpsL88位點1份突變標本由AAG突變為AGG,rrs513位點2份突變標本分別為514A→C和517C→T。與藥敏結果不符的9份耐藥標本實時檢測均為野生,經測序驗證,這9份標本的4個檢測區域均為野生型,證實了探針熔解分析法的準確性,同時也提示耐藥機制可能為這4個區域以外的基因突變或者是其它的耐藥機制如細胞膜通透性改變。

另外,這37份標本均為2008年初分離、培養及提取的,且經過多次實驗,凍融次數較多,加上基因組較容易斷裂,導致此批標本降解情況嚴重,因此會有部分標本無法擴增成功,瓊脂糖凝膠電泳后并無產物條帶,無法進行測序分析。而由于測序的3個片段采用不同的3對引物擴增,其擴增效率并不相同,rpsL片段的擴增效率較rrs513和rrs905這兩個片段的擴增效率高,37份標本rpsL片段的測序結果均正常,而rrs513和rrs905片段分別有16份和10份標本無目的條帶。

總之,所有有測序結果的標本或片段的測序結果均與探針熔解分析法檢測所得結果一致,驗證了探針熔解分析法的實用性。但有藥敏結果的標本數只有37份,探針熔解分析法仍需更多有藥敏結果的標本驗證,以體現此方法的可靠性。

3 討 論

由于結核分枝桿菌生長緩慢,經增菌培養再做藥物敏感性試驗一般需要4～6周,因此,對耐藥結核病患者的治療不能及時提供有效的指導,難以滿足臨床的需要,迫切需要快速檢測結核桿菌耐藥性的實驗方法。近年來逐漸發展了一些基于分子水平的檢測基因突變的方法,如單鏈構象多態性分析法(SSCP),限制性片段長度多態性分析法(RFLP),DNA測序法,線性探針雜交法等,相比于培養方法更為快速,在一定程度上提高了檢出率和通量,但是均需要進行PCR后處理,不僅影響了檢測效率,易引起擴增產物污染,而且增加了操作難度,提高了對實驗室的要求。相比之下,實時熒光PCR技術有著顯著的優點。首先,具有實時擴增實時檢測的優勢,大大節省檢測時間。本實驗的單個樣品的檢測時間只需2 h;沒有PCR后處理的步驟,減少了污染的機會;同時還具有多重 PCR高效、快捷、簡便、經濟等優點,可以同時對結核分枝桿菌鏈霉素耐藥多個相關基因突變同時進行檢測,特別適用于大批量篩查。

大多數菌株鏈霉素耐藥的產生是由于核糖體蛋白S12編碼基因(rpsL)和16S核糖體 RNA編碼基因(rrs)突變所致,70%以上的基因突變發生在rpsL43位點。本文所考察試劑盒針對rpsL43、rpsL88、rrs513～517和rrs905～908四個區域進行檢測,可以檢測到在這四個區域發生突變的全部菌株,但是對于未檢測出突變的并不能肯定該菌株對于鏈霉素為敏感。

本研究應用探針熔解分析法,篩查了906份結核分枝桿菌菌株。從檢測結果可以看出,有11.73%的標本存在基因突變,在四個檢測區域中,rpsL43位點的突變率最高,占到突變總數的77.67%;rrs513區域和rpsL88位點突變率次之,rrs905區域的突變率最低,占突變總數比例分別為10.68%、10.68%和0.97%。37份有藥敏結果的標本中,藥敏為敏感的標本用本研究所采用的方法所得結果均為野生型,說明本研究所采用的方法有很高的特異性。而藥敏為耐藥的16份標本僅檢測到7份突變,另外有9份標本實時檢測為野生,而且經測序確認,該檢測體系中的4個位點均未發生突變,可能是在這4個位點以外的基因上發生突變或者是其它的耐藥機制如細胞膜通透性改變。而由于目前只檢測了37份有藥敏結果的標本,藥敏結果為耐藥的標本只有16份,因此突變檢出率并不能真正反應此檢測體系的臨床靈敏度。

總之,本研究所采用的檢測體系與藥敏結果以及測序結果的一致性較好,檢測覆蓋范圍廣,并且操作簡便,檢測快速,符合臨床的需要,雖然受限于其自身耐藥突變的特點而無法檢出所有的耐藥結核分枝桿菌,但對于快速篩查結核分枝桿菌鏈霉素耐藥突變以及制定相應治療方案、從而降低耐藥菌株在人群中的傳播具有十分積極的意義,有望成為適合于臨床使用的診斷方法。

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