空腸彎曲菌外膜蛋白rOMP18的克隆表達及抗原性分析＊

喬 博,孟凡亮,顧一心,何利華,張 姝,肖 迪,劉國棟,曹芳芳,張建中,張茂俊

空腸彎曲菌(Campylobacter jej uni,C.jej uni)屬于嗜熱微需氧革蘭氏陰性彎曲菌,是引起人類急性腹瀉常見的病原體之一[1]。在許多國家的腹瀉患者中所占的比重已居首位,部分國家亦僅次于沙門菌或志賀菌。發(fā)展中國家空腸彎曲菌的感染率明顯高于發(fā)達國家,通常為發(fā)達國家的10～100倍[2]。除腸炎外,其研究證明空腸彎曲菌中某些菌株的感染還與格林-巴利綜合征(Guillain-BarréSyndrome,GBS)的發(fā)生有關(guān)[3]。

血清抗體的檢測結(jié)果通常不作為空腸彎曲菌感染的診斷依據(jù),但患者針對空腸彎曲菌抗體滴度的變化對于分析空腸彎曲菌感染后導致 GBS的病因分析具有重要意義[4]。目前空腸彎曲菌血清抗體檢測試劑缺乏,為獲得檢測空腸彎曲菌抗體的特異診斷抗原,本研究擬對空腸彎曲菌外膜蛋白18(outer membrane protein 18,簡稱 OMP18)進行克隆表達,并進一步檢測其抗原性。

OMP18是由空腸彎曲菌omp18基因編碼的分子質(zhì)量為18kD的外膜蛋白,該蛋白在彎曲菌屬中普遍存在,在同一個彎曲菌種內(nèi)又高度保守。因此OMP18抗原性評價對于空腸彎曲菌感染血清學診斷候選抗原的研究具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料 空腸彎曲菌(ICDCJ07001由本科室分離保存);表達質(zhì)粒pET32a(+)(Merk公司)和菌株E.coliBL21(DE3)(天根公司);Ex Taq酶,限制性內(nèi)切酶B amH I和XhoI,T4 DNA連接酶,(TaKaRa公司);瓊脂糖凝膠切膠回收試劑盒,質(zhì)粒小提試劑盒(天根公司);IDA His-Bind預(yù)裝純化柱(Novagen公司);辣根過氧化物酶標記 rSPA(北京博奧森生物技術(shù)公司);兔免疫血清(本科室)。

1.2 方法

1.2.1omp18的保守性分析在NCBI上下載已測序的omp18基因序列及其編碼的氨基酸序列,分別為 C8J_0106、JJD26997_0120、CJ E0108、CJJ81176_0148、CJ0113、ICDCCJ07001_106。運用 Vector NTI Suite 6分析其保守性。

1.2.2 PCR擴增 運用Swiss-Prot(http://www.expasy.ch/sprot/)預(yù)測OMP18蛋白的信號肽,Primer 5.0設(shè)計OMP18去掉信號肽后對應(yīng)基因的引物。上游引物:5′-B amHⅠCGCGGA TCC TGTAGCACAAAAA GCACTAGCGTA;下游引物:5′-X hoⅠCCGCTCGAG TCTTGA TAATTTAAATTCAGCACG,該引物由上海生工公司合成。PCR 擴增體系為50μl:10×buffer 5μL,dNTP 1μL,ICDCCJ07001 DNA(模板)2μL,上、下游引物各1.25μL(20μmol/L),Ex Taq 酶 (5U/μL)0.5μL,ddH2O 39μL。PCR擴增條件:95℃,預(yù)變性5min,然后按以下參數(shù)進行30個循環(huán):94℃變性30s,58℃退火 30s,72℃延伸 2min,最后 72℃延伸10min,4℃保存。取 PCR產(chǎn)物50μL,1.5%的瓊脂糖凝膠(0.01‰GelRed染色),80V電泳50min,在凝膠電泳成像儀下切膠。

1.2.3 pET32a-om p18重組質(zhì)粒的構(gòu)建 將瓊脂糖凝膠切膠回收的omp18 PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pET32a(+)分別用B amHⅠ和X hoⅠ進行雙酶切,酶切體系為30μL:10×K buffer 3μL,PCR產(chǎn)物與質(zhì)粒pET32a(+)各 18μL,B amH Ⅰ與XhoⅠ各1.5μL,ddH2O 6μL。30℃酶切 1h,37℃酶切 2h。酶切產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖切膠回收。omp18和pET32a(+)以摩爾比3∶1的比例混合加入 T4連接酶16℃過夜連接。取連接產(chǎn)物5μL轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞,將轉(zhuǎn)化菌均勻涂布于含氨芐青霉素(AMP100μg/mL)的 LB平板上,37℃過夜培養(yǎng)后挑選單菌落接種于5mL含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中,37℃,180r/min過夜孵育,質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒,進行單、雙酶切鑒定,陽性重組質(zhì)粒命名為pET32a-omp18。

1.2.4 OMP18的誘導表達、存在狀態(tài)分析及純化將陽性克隆子菌落接種到5mL含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中,37℃,200r/min搖至菌液濃度OD約為0.8～1.0時加入終濃度為1mmol/L的IPTG,30℃誘導表達4h。于兩個離心管內(nèi)分別吸取菌液樣品各1mL,0.01 mol/L的PBS洗菌兩遍,其中一管加入終濃度為1×SDS-PAGE上樣緩沖液,100℃水浴5min,12 000g離心5min,取上清用于表達產(chǎn)物分析。另一管超聲破碎菌體分離上清和沉淀,上清中加入終濃度為1×SDS-PAGE上樣緩沖液,沉淀先以30μL生理鹽水懸浮混勻,再加入終濃度為1×SDS-PAGE上樣緩沖液,這兩樣品用于分析重組蛋白的存在狀態(tài)。將上述樣品進行SDSPAGE電泳分析,5%濃縮膠和12%分離膠電泳,考馬斯亮藍R250染色。OMP18純化采用的是 IDA His-Bind預(yù)裝純化柱,按其說明書操作。

1.2.4 Western-blot分析 表達產(chǎn)物SDS-PAGE電泳后將凝膠,濾紙,PVDF膜置于轉(zhuǎn)膜液中浸泡活化30min后,至半干式電轉(zhuǎn)印儀25V轉(zhuǎn)印60min,用含0.1%Tween20的 TBS(TBST)洗膜5次,每次5min,然后轉(zhuǎn)入封閉液(1×PBS+0.5%脫脂奶粉)中,4℃封閉過夜;取出 PVDF膜,用 TBST洗膜5次,每次5min;加入1∶50一抗反應(yīng)液(空腸彎曲菌免疫前、后兔血清)37℃緩慢搖動孵育60min;取出PVDF膜用 TBST洗膜 5次,每次 5min;加入1∶40 000二抗反應(yīng)液(辣根過氧化酶標記rSPA)37℃緩慢搖動孵育60min;洗膜后加入DAB(6mgDAB、10uL H2O2、1×PBS稀釋至10mL)顯色后用蒸餾水終止反應(yīng)。

2 結(jié) 果

2.1omp18基因測序菌株DNA保守性分析

2.1.1om p18基因的保守性分析以om p18基因前200bp為例,顯示omp18基因及其編碼的氨基酸序列具有高度保守性,見圖1。

2.1.2omp18編碼氨基酸的保守性分析 見圖2

2.2 PCR擴增om p18及重組質(zhì)粒的酶切鑒定PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)果顯示擴增產(chǎn)物在444bp左右(圖3)。將重組表達質(zhì)粒經(jīng)B amHⅠ和X hoⅠ單、雙酶切后在1.5%的瓊脂糖凝膠中電泳(圖4),獲得預(yù)期大小的基因片段,表明表達質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 omp18(1-200bp)DNA序列比對分析Fig.1 Comparison of DNA sequence foromp18(1-200bp)inC.jej uni

圖2 OMP18氨基酸序列比對分析Fig.2 Comparison of amino acid sequence forOMP18 in C.jejuni

圖3 omp18基因擴增結(jié)果Fig.3 Results of PCR product ofomp18 1.DNA markerⅤ;2.PCR product ofomp18

2.3 rOMP18存在狀態(tài)分析及純化表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析結(jié)果參見圖5,從圖中可看出誘導后的pET32a-omp18有表達,該蛋白以包涵體形式存在,沉淀經(jīng)8mol/L尿素溶解后用 His純化柱純化得到較高純度的重組rOMP18蛋白,該重組蛋白是與純化標簽 HIS結(jié)合的融合蛋白,分子量為34kD(HIS16kD)左右。

2.4 Western-blot分析 Western-blot結(jié)果見圖6,rOMP18蛋白對空腸彎曲菌免疫兔血清有較好的抗原性(圖中第8條帶)。

3 討 論

外膜蛋白通常是病原細菌的疫苗成分以及特異診斷抗原的候選蛋白。鞭毛蛋白A(flagellin A,FLA),外膜蛋白 PEB1(periplasmic solute-binding protein 1,PEB1),外膜蛋白 PEB3(periplasmic solute-binding protein 3,PEB3)已被證實其在空腸彎曲菌中的抗原性[9],但是FLA蛋白抗原性的多變與其f la基因型多變是一致的[7-8]。而且空腸彎曲菌有很多蛋白是受溫度調(diào)控的蛋白。因此尋找一個抗原性穩(wěn)定的蛋白對空腸彎曲菌的免疫學診斷具有重要的意義。

圖4 pET32a-omp18重組質(zhì)粒酶切鑒定Fig.4 Results of recombinant plasmid pET32a-omp18 ested by endoenzymes1.DNA MarkerⅢ;2.pET32a-omp18 esterd by Bam HⅠandXhoⅠ;3.pET32a-omp18 esterd by Bam HⅠ

圖5 轉(zhuǎn)化體BL21-OMP18表達產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳Fig.5 SDS-PAGEandlysis for BL21-OMP181.protein molecular weight standard;2.rOMP18 before induction in BL21;3.rOMP18 after induction in BL21;4.precipitation in BL21;s5.upermatant in BL21;6.purified products of rOMP18

圖6 rOMP18的Western-blot分析Fig.6 Western blot analysis of products of rOMP18 1,5.protein molecular weight standard;2-6 protein of ICDCCJ07001;3,7.protein ofMycobacterium tuberculosis;4,8.purified products of OMP18

omp18在空腸彎曲菌內(nèi)是單拷貝基因,長498bp,其中(G+C)約為 33.5%,編碼 165個氨基酸。Vector NTI Suite 6分析顯示omp18也是保守基因,Andre B[9]等人用該基因的引物擴增了從不同宿主(人、狗、雞等)體內(nèi)分離到的空腸彎曲菌都能得到陽性的擴增條帶,又用southern-blot驗證了彎曲菌中空腸彎曲菌(C.jejuni)、結(jié)腸彎曲菌(C.coli)、胎兒彎曲菌(C.lari)、烏普薩拉彎曲菌(C.upsaliensis)、瑞士彎曲菌(C.helveticus)omp18基因的普遍性并具有相似性。

OMP18蛋白屬于細菌的PALs(peptidoglycanassociated lipoproteins)蛋白家族,PALs在細胞外膜與肽聚糖之間起橋聯(lián)作用參與細胞壁的構(gòu)成并保持其完整性[10]。OMP18蛋白在空腸彎曲菌內(nèi)普遍存在,分子量大小為18kD,其 N端的前18個氨基酸組成信號肽,指導OMP18蛋白定位在空腸彎曲菌的表面[4]。與空腸彎曲菌OMP18蛋白相似相似的外膜蛋白有:流感嗜血桿菌(Haemophilus inf luenzae)的外膜蛋白PAL(P6)有36%的氨基酸序列相似[11],與大腸桿菌(Escherichia coli)的 PAL蛋白有32%的氨基酸序列相似[12],但用空腸彎曲菌制備的OMP18單克隆抗體驗證了其能與所有彎曲菌的OMP18蛋白結(jié)合與幽門螺桿菌、流感嗜血桿菌、大腸桿菌等無非特異性反應(yīng)[9]。本研究建立的用pET32a(+)載體表達 ICDCCJ07001的OMP18蛋白是去掉信號肽后,其N端與載體上6個連續(xù)的組氨酸標簽相連接的融合蛋白,并且pET32a(+)的組氨酸標簽為后續(xù)的純化工作提供了便利。Western-blot檢測rOMP18蛋白能與空腸彎曲菌免疫兔血清結(jié)合,證明該重組蛋白具有抗原性。本研究所用的一抗是三組抗體包括了不同血清型的空腸彎曲菌菌株,分別為 GBS爆發(fā)株、GBS散發(fā)株、腹瀉株。ICDCCJ07001是2007年導致我國長春發(fā)生GBS暴發(fā)的空腸彎曲菌,用此菌株做為克隆表達的模板可以初步驗證OMP18蛋白在我國臨床標本中的抗原性,為以后大量標本的檢測奠定基礎(chǔ)。

本研究成功構(gòu)建了空腸彎曲菌rOMP18基因的原核表達系統(tǒng),并分析了表達產(chǎn)物的抗原性,為空腸彎曲菌血清學診斷提供了候選抗原。

[1]Blaser MJ,Taylor DN,Feldman RA.Epidemiology ofCampylobacter jejuniinfections[J].Epidemiolc Res,1983,5:157-176.

[2]Blaser MJ.Epidemiologic and clinical features ofCampylobacterjejuni infections[J].J Infect Dis,1997,176(2):103-105.

[3]Ben M,Amjad AI,Koski CL,et al.Serologic evidence of previousCampylobacter jejuniinfection in patients with the Guillain-Barrésyndrome[J].Ann Intern Med,1993,118:947-953.

[4]Michael EK,David JM,Witold CJ.Cloning,sequencing,and expression of a gene fromCampylobacter jejuniencoding a protein(Omp18)with similarity to peptidoglycan-associated lipoproteins[J].Infection and Immunity,1996,64(5):1850-1853.

[5]Pitk nen T,P nk A,Pettersson T,et al.Campylobacterenteritis in 188 hospitalized patients[J].Arch Intern Med,1983,143:215-219.

[6]Khawaja R,Kuldeep N,Hermine LB,et al.Cloning and sequence analysis of thef lagellingene ofCampylobacter jejuniTGH9011[J].Curr Microbiol,1992,24(4):213-221.

[7]Alm RA,Guerry P,Power ME,et al.Variation in antigenicity and molecular weight ofCampylobacter coliVC167 flagellin in different genetic backgrounds[J].J Bacteriol,1992,174(13):4230-4238.

[8]Alm RA,Guerry P,Trust TJ.Distribution and polymorphism of thef lagellingenes from isolates ofCampylobacter coliandCampylobacter jejuni[J]. J Bacteriol,1993,175 (10):3051 3057.

[9]Burnens A,Stucki U,Nicolet J,et al.Identification and characterization of an immunogenic outer membrane protein of campylobacter jejuni[J].J Clin Microbiol,1995,33,(11):2826-2832.

[10]Lazzaroni JC,Portalier R.TheexcCgene ofEscherichia coliK-12 required for cell envelope integrity encodes the peptidoglycanassociated lipoprotein(PAL)[J].Mol Microbiol,1992,6(6):735 742.

[11]Nelson MB,Apicella MA,Murphy TF,et al.Cloning and sequencing ofHaemophilus inf luenzaeouter membrane protein P6[J].Infect Immun,1988,56:128 134.

[12]Lazzaroni JC,Portalier R.TheexcCgene ofEscherichia coliK-12 required for cell envelope integrity encodes the peptidoglycanassociated lipoprotein (PAL)[J].Mol Microbiol,1992,6:735-742.