H9亞型禽流感病毒RT-LAMP可視化檢測方法的建立＊

彭 宜,謝芝勛,劉加波,龐耀珊,鄧顯文,謝志勤,謝麗基,范 晴

禽流感(Avian Influenza,AI)是由正黏病毒科流感病毒屬A型流感病毒引起的一種禽類(家禽和野禽)傳染病[1]。根據禽流感病毒(AIV)的致病性強弱,禽流感可分為高致病性禽流感、低致病性禽流感和無致病性禽流感[2-3]。高致病性禽流感是由H5亞型和 H7亞型病禽流感毒引起的,以全身感染、高發病率和高死亡率為特征。H9亞型禽流感雖屬于低致病性禽流感,但可造成蛋雞的產蛋量嚴重下降,肉雞和青年雞的復合型呼吸道疾病和死淘率升高,給我國的養禽業造成了嚴重的經濟損失。近年來內地和香港陸續出現的 H9N2亞型AIV跨越宿主屏障直接感染人的事件,更是給人類的健康帶來了巨大威脅[4-5]。因此迫切需要建立 H9亞型禽流感病毒的快速檢測技術,為我國 H9亞型禽流感的防控提供技術支撐。

環介導等溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是由 Notomi等[6]于2000年建立的一種新型核酸擴增技術,其原理是通過識別靶序列上8個特異區域的引物和一種具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶,在等溫條件下進行自動循環的鏈置換核酸擴增反應,反應中會產生大量肉眼可見的白色沉淀。該技術具有特異性高、操作簡便、反應迅速、成本低廉等優點,目前在一些病原微生物的檢測中開始被廣泛運用[7]。本研究根據LAMP原理,優化相關反應條件,建立了適合基層的H9亞型禽流感病毒逆轉錄環介導等溫擴增(RT-LAMP)快速檢測方法。

1 材料與方法

1.1 毒株 H3、H9亞型AIV由本實驗室分離鑒定,H5N2、H7N2亞型禽流感病毒 RNA為美國賓夕法尼亞州立大學禽病診斷研究室惠贈;新城疫病毒(NDV)F48、傳染性支氣管炎病毒(IBV)M41、傳染性喉氣管炎病毒(IL TV)北京株及雞毒霉形體(MG)S6由本實驗室保存提供。

1.2 試劑 Bst DNA聚合酶(大片段)、MgSO4、Betaine購自New England Biolabs公司。AMV反轉錄酶、EcoRⅠ、EcoRⅤ、dNTP購自 TaKaRa公司。SPF雞胚購自北京梅里亞公司。SYBR Green I熒光染料購自北京Solarbio公司。RNA提取試劑 TRIzol LS Reagent購自Invitrogen公司。

1.3 引物的設計與合成 下載 GenBank中 H9亞型AIV的 HA基因序列,利用Lasergene軟件進行多序列比對,在保守區運用在線軟件 Primer Explorer V4設計LAMP引物。引物包括外引物、內引物和環引物,其中 F3和B3為外引物,FIP(F1c+GAATTC+F2)和BIP(B1c+GA TATC+B2)為內引物,LF和LB為環引物。F1c、F2和B1c、B2之間分別為EcoRⅠ和EcoRⅤ酶切位點,引物由上海Invitrogen公司合成。引物序列見表1。

1.4 RNA抽提 參照 TRIzol LS Reagent使用說明書和文獻[8]進行病毒 RNA抽提,-70℃保存備用。

1.5 RT-LAMP反應條件的優化 對反應體系在如下范圍內進行優化:MgSO4(0.6～9mmol/L)、Betaine(0.2～1.9mmol/L)、Bst DNA PoLymerase(4～14U)、dNTP(0.6～1.6mmol/L)。將溫度按59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃依次遞增,多次重復試驗后確定最佳退火溫度。

表1 RT-LAMP引物序列Table 1 Sequences of RT-LAMP primers

1.6 特異性和靈敏度檢驗 利用優化好的 RTLAMP反應體系,以 H3、H5、H7、H9亞型 AIV 及NDV 、IBV、IL TV、MG核酸為待檢樣品進行檢測,檢驗RT-LAMP方法的特異性。將制備的H9亞型禽流感病毒RNA按10倍遞增稀釋,并使用Beckman UV-800紫外分光光度計測定稀釋后各個梯度的 RNA 濃度 ,分別為 1 ng、100 pg、10 pg、1 pg、0.1 pg、0.01pg、1fg。對各濃度 RNA 用 RT-LAMP方法進行檢測,并用一步RT-PCR方法同時進行擴增。1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察結果確定該方法的靈敏度。

1.7 臨床樣品檢測 利用建立的 H9亞型禽流感病毒RT-LAMP方法對本實驗室分離的6株H9亞型AIV進行擴增,驗證RT-LAMP方法的可靠性。1.8 RT-LAMP產物酶切鑒定 RT-LAMP反應結束后,采用限制性內切酶EcoRⅠ和EcoRⅤ進行酶切鑒定,酶切體系如下:RT-LAMP產物6μL、10×buffer 2μL、EcoR Ⅰ2μL、EcoR Ⅴ2μL、去離子水8μL,37℃作用過夜。酶切產物用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳。

1.9 RT-LAMP反應結果的可視化觀察

1.9.1 比濁法 RT-LAMP反應結束后直接觀察管內溶液渾濁度,隨后采取離心的方法(8 000r/min,3min)使生成的焦磷酸鎂懸濁液形成白色沉淀,通過觀察反應管底部的白色沉淀來判定結果。1.9.2 熒光法 RT-LAMP反應結束后加入25×SYBR Green I染料1μL,充分混勻后觀察溶液顏色變化,并將溶液置于365nm紫外光下觀察有無熒光產生。

2 結 果

2.1 RT-LAMP反應條件的優化 通過對各反應條件優化后,最終確定各組份的終濃度為 F3、B3引物各 0.2μmol/L,FIP、BIP 引物各 1.6μmol/L,LF和LB引物各 0.8μmol/L,Mg2+7mmol/L,dNTP 0.8 mmol/L,Betaine 1 mmol/L,Bst DNA PoLymerase 8U,AMV 5U,去離子水3.5μL,反應總體系為25μL。置63℃水浴鍋中,反應45min,80℃作用5min終止反應。

2.2 特異性檢驗 如圖1所示,只有 H9亞型AIV樣品為陽性結果,H3、H5、H7亞型AIV及NDV 、IBV、IL TV、MG均沒有特征性梯形條帶出現。

2.3 靈敏度檢驗 如圖2、圖3所示,該方法對 H9亞型AIV RNA的最小檢測限為0.01pg,靈敏度是一步法RT-PCR方法的1000倍。

2.4 臨床樣品檢測如圖4所示,臨床分離的6株H9亞型AIV均出現特征性梯形條帶,與預期結果相符。

圖1 RT-LAMP方法檢測 H9亞型AIV的特異性Fig.1 Specificity of RT-LAMPassay for detection of H9 subtype AIVM:100bp DNA Ladder;1:Blank control;2-9:IBV,IL TV,MG,NDV,H3 subtype AIV,H5 subtype AIV,H7 subtype AIV,H9 subtype AIV,respectively

圖2 RT-LAMP靈敏度試驗結果Fig.2 The results of RT-LAMP sensitivity testM:100bp DNA Ladder;1:Blank control;2-8:Different concentration of H9 subtype AIV RNA(1ng,100pg,10pg,1pg,0.1pg,0.01pg,1fg/tube,respectively)

2.5 RT-LAMP產物酶切鑒定 擴增產物通過EcoRⅠ、EcoRⅤ酶切后,出現與預期大小相符的兩條主帶及少量大小不同的條帶,如圖5所示。

圖3 RT-PCR靈敏度試驗結果Fig.3 The results of RT-PCR sensitivity testM:100bp DNA Ladder;1:Blank control;2-8:Different concentration of H9 subtype AIV RNA(1ng,100pg,10pg,1pg,0.1pg,0.01pg,1fg/tube,respectively)

圖4 廣西分離株 H9亞型AIV RT-LAMP擴增結果Fig.4 The results of RT-LAMP for detection of H9 subtype AIV isolated in GuangxiM:100bp DNA Ladder;1:Blank control;2-7:Products of RT-LAMP forH9 subtype AIV isolated in Guangxi

圖5 RT-LAMP產物的酶切鑒定Fig.5 Products digested byEcoRIandEcoRVM:100bp DNA Ladder;1:Blank control;2:Products digested byEcoRI andEcoRV

2.6 RT-LAMP反應結果的可視化觀察

2.6.1 比濁法 RT-LAMP反應中會生成白色焦磷酸鎂沉淀懸浮在溶液中,經離心后在管底可見白色沉淀,陰性對照管則無沉淀產生,如圖6A所示。

2.6.2 熒光法 RT-LAMP反應結束后在產物中加入25×SYBR Green I染料,肉眼可見陽性管溶液迅速變綠,陰性對照管溶液為較淺的桔紅色,如圖6B所示;在紫外光下陽性管溶液發出明亮熒光,陰性對照管溶液沒有熒光,如圖6C所示。

圖6 RT-LAMP結果可視化觀察Fig.6 Visual inspection of the results of RT-LAMPA:Results of RT-LAMP confirmed by white sediment;B:Results of RT-LAMP under daylight after adding SYBR GreenⅠ;C:Results of RT-LAMP under UV light after adding SYBR GreenⅠ;1:Positive reaction;2:Negative reaction

3 討 論

LAMP技術是一種簡便、快速、靈敏、成本低廉的新型核酸擴增技術。該技術利用Bst DNA聚合酶在60～65℃具有核酸雙鏈解鏈功能和瀑布式核酸擴增功能,在等溫條件下即可進行核酸的變性和擴增,不需要特殊的儀器設備,僅在水浴鍋中就可完成擴增反應[9]。LAMP技術在目的基因保守區設計了針對8個特異區域的6條引物,使擴增反應具有很高的特異性,在內引物之間增加兩條環引物提高了擴增效率,縮短了反應時間。LAMP反應結果的觀察方法非常簡便,在反應過程中焦磷酸根離子會與Mg2+結合產生大量的副產物焦磷酸鎂,使反應液變渾濁,離心后可見白色沉淀,另外極高的擴增效率使得反應液中有大量的雙鏈核酸,所以反應結束后向反應液中加入熒光染料,反應液會變成翠綠色,在紫外線下可見較強的綠色熒光,如沒有擴增反應則反應液加染料后為桔紅色,在紫外線下也無綠色熒光[10-11]。由于LAMP反應的擴增效率很高,在少量cDNA存在的條件下就可進行核酸的大量擴增,所以只需要在LAMP反應體系中加入反轉錄酶,就可以完成 RNA的檢測(RT-LAMP)。RTLAMP技術具有特異性強、儀器設備簡單、結果便于觀察的特點,應用前景廣闊。

本研究建立的 H9亞型禽流感病毒RT-LAMP檢測方法能特異的檢測 H9亞型AIV,并且表現較高的靈敏度,RNA的最小檢測限為0.01pg,是常規RT-PCR的1000倍。整個反應只需要在水浴鍋中50min即可完成。由于RT-LAMP反應具有較高的靈敏度,反應試劑、反應器材及環境易因受到微量RNA模板污染而導致假陽性結果的出現,另外RTLAMP反應擴增效率極高,打開反應管時,反應產物易形成氣溶膠而污染周圍環境,所以不僅配制反應體系時要注意操作防止RNA模板污染試劑,而且應將配制反應體系的區域與觀察反應結果的區域進行嚴格分區,防止假陽性結果的出現。本研究對RT-LAMP反應體系進行了優化,擴增效率極高,反應過程中產生大量的焦磷酸鎂,反應結束后對比陰性樣品反應液明顯可見陽性樣品反應液變渾濁,離心后在反應管底部可見白色沉淀,既實現了 RTLAMP反應結果的可視化觀察,也避免了打開反應管蓋而造成環境的污染。

近年來,H9亞型禽流感病毒不僅能感染禽類給養禽業造成巨大經濟損失,而且能突破宿主屏障直接感染人,演變為人類健康的嚴重威脅。本研究建立的H9亞型禽流感病毒RT-LAMP檢測方法尤其適合在基層獸醫站和養殖場進行快速檢測,對指導我國H9亞型禽流感的防控具有重要意義。

[1]甘孟侯.禽流感[M].北京:北京農業大學出版社,2002:74-78.

[2]Alexander DJ.A review of avian influenza in different bird species[J].Vet Microbiol,2000,74:3-13.

[3]Edwards S.OIE laboratory standards for avian influenza[J].Dev Bio(Basel),2006,124:159-162.

[4]郭元吉,吳昆昱,董婕,等.流感病毒A/廣州/333/99(H9N2)毒株基因組特性的研究[J].中華實驗和臨床病毒學雜志,2002,14:209-212.

[5]Peiris M,Yuen KY,Leung CW,et al.Human infection with influenza H9N2[J].Lancet,1999,354:916-917.

[6]Notomi T,Okayama H,Masubuchi H,et al.Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J].Nucleic Acids Res,2000,28(12):e63.

[7]汪一帆,郭潮潭.環介導等溫擴增技術及在感染病診斷中的應用[J].中國衛生檢驗雜志,2008,18(9):1933-1935.

[8]Lee MS,Chang PC,Shien J H,et al.Identification and subtyping of avian influenza viruses by reverse transcription-PCR[J].J Virol Methods,2001,97:13-22.

[9]Tomita N,Mori Y,Kanda H,et al.Loop-mediated isothermal amplification(LAMP)of gene sequences and simple visual detection of products[J].Nature Protocal,2008,3(5):877-882.

[10]Poon L LM,Leung C SW,Chan KH,et al.Detection of human influenza A viruses by loop-mediated isothermal amplification[J].J Clin Microbiol,2005,43:427-430.

[11]Mori Y,Nagamine K,Tomita N,et al.Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation[J].Biochem Biophys Res Commun,2001,289:150-154.