大鼠聽覺發育中聽覺敏感度及時間分辨率的變化

余新 王堅 殷善開

聽覺敏感度即聽敏度，是辨別不同頻率和強度聲音的能力。時間分辨率是聽覺系統對聲音信號快速變化做出反應的能力，時間分辨率主要通過間隔探測實驗來衡量，即測量受試者在一個連續的聲音中，探測出一個短暫的無聲間隔的能力。一般以能夠探測到的最短的無聲間隔的時程，即間隔閾值代表聽覺系統對時間的分辨能力。動物實驗中，以往通常采用電擊、飲食剝奪等方法建立條件反射以進行行為學間隔測試，上述方法無法保證測試個體身體狀態的一致性從而影響結果的準確性，且相對殘酷，已逐漸被淘汰。聽覺驚跳反射前抑制試驗近來以其簡單、無創的優點廣為運用。聽覺驚跳反射(acoustic startle response, ASR)是指人或動物對突然出現的強烈聲音刺激產生的防御性行為反射，表現為突然的面部、頸部和肢體骨骼肌的運動。驚跳反射前抑制(prepulse inhibition，PPI)是指在驚跳刺激(startle stimulus，SS)前適當時間(因此稱為前刺激，prepulse stimulus，PS)給予一個一定時程和強度的閾下刺激(即不能引起驚跳反射的刺激)抑制驚跳反射，使驚跳反應幅度減小，潛伏期延長的現象。PPI測試可用于觀察聽覺系統對前刺激處理的能力。

近期許多學者采用間隔抑制試驗，即以鑲嵌在背景噪聲中的無聲間隔(silent gap)作為前刺激來研究受試動物的時域處理能力[1]。不同時程的gap鑲嵌在60～75 dB的背景噪聲中，其后大約20～100 ms跟隨一個驚跳刺激，因為只有當動物感受到gap才能對驚跳反射有明顯的抑制作用，因此，可以通過該方法測得受試動物的前刺激抑制率或間隔閾值，從而對受試動物時域處理能力進行研究。

目前運用gap-PPI測試手段研究大鼠時間分辨率發育與聽敏度發育的相關性仍較少。本試驗運用gap-PPI及ABR測試研究大鼠聽覺時間分辨率和聽敏度的發育及其相互關系。在gap-PPI測試中，以攜帶不同時程的gap作為驚跳反射前刺激，研究大鼠聽覺系統發育過程中時間分辨率的改變。攜帶gap的背景噪聲的頻率采用大鼠最敏感且發育最早的頻率，即8～32 kHz，并排除擴大的頻率帶寬對間隔測試的影響。同時也采用1～48 kHz的背景噪聲作為對比，觀察大鼠發育過程中時間分辨率的變化及帶寬對其的影響。另外，為了排除PPI測試的經驗效應對間隔閾值的影響，每只大鼠只進行一次gap-PPI測試，報告如下。

1 材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物 日齡為14、16、18、22、26、30、35天的新生SD大鼠各20只，共140只。雌雄不限，耳廓反射正常，耳鏡檢查排除外耳道耵聹栓塞及中耳感染。

1.1.2實驗試劑及儀器 鹽酸氯胺酮注射液，2%鹽酸利多卡因注射液。TDT system 3、TDT ES1 揚聲器、Startle reflex 軟件、Biosig 軟件、壓電轉換器和LP-4電熱毯、鐵籠大小7 cm×5 cm×5 cm (長×寬×高)(自制)。

1.2實驗方法

1.2.1各日齡實驗大鼠隨機分為A、B兩組，每組10只。A組大鼠gap-PPI測試標記gap的背景噪聲帶寬為1～48 kHz，B組大鼠的背景噪聲帶寬為8～32 kHz，背景噪聲的強度均為75 dB SPL。各日齡的兩組大鼠均先進行ABR測試，然后進行gap-PPI測試。

1.2.2ABR測試 所有刺激信號的產生和誘發電位的記錄均由TDT system 3系統硬件和軟件完成。ABR閾值為1～48 kHz范圍內各倍頻程點短純音的響應閾值。短純音上升、下降時間為0.5 ms，時程為10 ms，刺激重復率為11.1次/秒。大鼠經鹽酸氯胺酮肌肉注射麻醉后置于恒溫電熱毯上，保證大鼠體溫穩定在37.5℃左右，1%利多卡因于大鼠的顱頂及兩側乳突皮下局部注射，記錄電極刺入顱頂皮下，參考及接地電極分別刺入左、右側乳突皮下。刺激聲從90 dB SPL開始，5 dB下降一檔，以剛剛誘發出可辨認的波V的最小聲強值為ABR反應閾值。

1.2.3gap-PPI測試 如圖1所示，聽覺驚跳反射的記錄在屏蔽隔聲室進行，一次可同時測試多個動物。其主要測試裝置為載有敏感壓電轉換器的鐵籠，鐵籠大小根據受試動物大小而定，以適度限制動物活動為佳。驚跳刺激信號由TDT system 3系統(Tucker-Davis Technologies, TDT)硬件和軟件完成，并通過懸掛在鐵籠上方10 cm處的高頻揚聲器傳出。當動物發生驚跳反射時，軀體運動通過垂直力作用于鐵籠，經鐵籠底部的壓電傳感器輸出信號接入另一個實時處理系統(TDT)，經過放大(10-100X)和濾過(10～300 Hz)，輸入到實時處理器中 (RP2.1, TDT)， ASR的峰峰值由基于TDT硬件的startle reflex軟件計算。在聽覺驚跳反射前抑制的記錄中，前刺激信號也由TDT system 3系統硬件和軟件完成，通過懸掛在鐵籠上方10 cm處的高頻揚聲器傳出，前刺激的聽覺驚跳反射(acoustic startle response with prepulse，ASRp)的記錄和峰峰值計算和ASR的記錄方法一致。

圖1 聽覺驚跳反射前抑制模式圖[2]

在gap-PPI的記錄中，由一個高頻揚聲器輸出驚跳刺激信號，另一個高頻揚聲器輸出背景噪聲和gap。驚跳刺激信號為115 dB SPL (持續時間20 ms,上升/下降時間0.1 ms)，前刺激信號為插入在75 dB SPL背景噪聲中的不同時程無聲間隔(gap)，其時程分別為0、1、2、4、6、8、10、15、25、50、100 ms,上升/下降時間0 ms，0 ms的間隔測試為僅有驚跳刺激的測試，反映驚跳反射的基值。實驗采用2個不同帶寬的背景噪聲，分別為1～48 kHz和8～32 kHz。實驗間隔(inter-trial interval, ITI)為相鄰兩個驚跳刺激信號之間的間隔，在16～24 s之間，平均ITI為20 s，以避免前面刺激產生的不應期對后面刺激的影響。另外，隨機變化的實驗間隔較固定的間隔更少出現驚跳反射的適應性，并可防止動物產生期待情緒。單組實驗流程包括：背景噪聲—插入gap—背景噪聲—驚跳刺激信號。

1.3統計學方法 所有數據經sigma state統計軟件分析。在研究聽敏度的發育中，以每組各時間點大鼠各頻率段的ABR閾值為自變量，日齡和頻率為兩個因素，進行雙因素方差分析。文獻報道[3]大鼠在生后14天ABR才能夠引出，到第35天左右，聽敏度和成年鼠無差異，所以本實驗將35天齡大鼠的ABR作為標準對照。故每個日齡大鼠的ABR閾值均與第35天的ABR閾值比較，有統計學差異表示該日齡大鼠的聽敏度尚未發育成熟，無統計學差異則表示該日齡的聽敏度已經發育成熟。間隔閾值(gap threshold)通過配對t檢驗，比較各時程的gap(1、2、4、6、8、10、15、25、50、100 ms)引起的ASRp與ASR基值(gap為0 ms)而得，以具有統計學差異的最短gap為間隔閾值。

PPI%是 ASRp和ASR的比值，可用于比較不同日齡大鼠在間隔探測中的表現。采用雙因素方差分析，比較日齡(7個水平,14、16、18、22、26、 30、 35天)和無聲間隔(10個水平,1、2、4、6、8、10、15、25、50、100 ms)雙因素的作用及可能相互作用，如果發現某一因素的顯著性作用后，再用兩兩比較的方法決定具有顯著作用的因素水平。

2 結果

2.1日齡增加對間隔閾值的影響 圖2為兩組大鼠在不同背景噪聲下的間隔閾值。可見，大鼠間隔閾值隨日齡增加而下降，表明隨著聽覺系統的發育，大鼠的時間分辨率增加，時域處理能力增強。另一方面，相對于8～32 kHz的背景噪聲，1～48 kHz背景噪聲時的間隔閾值明顯下降(P=0.013)，也證實了隨著攜帶gap的背景噪聲頻率帶寬的增寬或頻率的提高，時間分辨率越佳。

圖2 不同背景噪聲下兩組大鼠的間隔閾值

表1 各日齡組大鼠在兩種背景噪聲下不同無聲間隔時間的PPI%

注：在背景噪聲為1～48 kHz時，30天大鼠的時間分辨率與35天大鼠差異無統計學意義(P>0.05)。在背景噪聲為8～32 kHz時，30天大鼠時間分辨率與35天差異無統計學意義(P=0.138)

表2 不同日齡大鼠的各頻率ABR閾值(dB SPL)

注：雙因素方差分析示1、2和4 kHz頻率的ABR閾值第26天與35天差異無統計學意義[P(1 kHz)=0.098;P(2 kHz)=1.000;P(4 kHz)=0.715]；16和 32 kHz的ABR閾值第22天與35天差異無統計學意義[P(16 kHz)=0.072;P(32 kHz)=0.920]；8 和48 kHz的ABR閾值第18天與35天差異無統計學意義[P(8 kHz)=0.104;P(48 kHz)=0.527]。

2.2日齡增加對PPI%的影響 表1結果顯示在背景噪聲為1～48 kHz時，第30天大鼠的時間分辨率才發育成熟。當背景噪聲為8～32 kHz時，雖然大鼠的間隔閾值提高，但同樣到第30天時，時間分辨率才發育成熟。不同日齡在不同背景噪聲下大鼠PPI%的變化趨勢，gap時程越長，PPI%越小；日齡增加，PPI%越小。

2.3不同日齡大鼠ABR反應閾比較 生后14、16、18、22、26、30及35天大鼠的ABR閾值見表2。1、2和4 kHz頻率的ABR閾值第26天與35天無統計學差異；16和 32 kHz的ABR閾值第22天與35天無統計學差異；8 和48 kHz的ABR閾值第18天與35天無統計學差異。所以到生后第26天，大鼠各頻率聽敏度已達到正常水平。

3 討論

Friedman[3]運用gap-PPI測試手段研究大鼠的時間分辨率與年齡以及經驗的相關性。他們選用生后15天、35天及64天的大鼠，每只大鼠均進行連續5天的測試，結果發現隨年齡增加，間隔探測閾值下降，生后15天和35天大鼠的間隔閾值在10～20 ms之間，而生后64天大鼠則為5～10 ms。經過連續5天的測試，所有年齡組大鼠的間隔閾值均比第一天下降，這一現象提示在發育早期和成熟期，感覺處理中存在依賴經驗的可塑性機制。然而，生后15天大鼠的聽覺系統發育尚未完善，且生后10天至20天是大鼠聽覺發育最快的時期，因此連續5天測試后間隔閾值的降低不僅僅有經驗依賴性的影響，快速發育完善的聽功能也起了重要的作用，Friedman的實驗無法區分聽覺系統發育、經驗及其相互作用。

本研究結果發現，兩種背景噪聲下，都可觀察到隨日齡增加，間隔閾值降低，時間分辨率提高。證實了攜帶gap的背景噪聲的頻譜越寬，間隔閾值越低，在背景噪聲為8～32 kHz時獲得的間隔閾值普遍比1～48 kHz時要高，其原因在于通過整合多頻率上的信息獲得了更佳的時間分辨率。在背景噪聲為1～48 kHz時，無法排除日益發育、增加的可聽頻率范圍間隔探測的影響。有文獻[4]表明2～4 kHz背景噪聲下，間隔閾值大于29 ms； 4～8 kHz噪聲下的間隔閾值為16 ms；8～16 kHz噪聲下的閾值為7 ms，16～32 kHz和32～64 kHz背景噪聲下的間隔閾值是2 ms。因此，1～48 kHz背景噪聲下所測得的間隔閾值，不能精確反應時間分辨率的發育和聽敏度發育的關系。本研究結果還顯示兩種背景噪聲下的大鼠的時間分辨率均在第30天發育成熟，與第35天大鼠相比無統計學差異，這種結果的差異性有待進一步研究。

發育中大鼠ABR的變化直接反映了大鼠內耳和聽覺傳導通路的成熟過程，大鼠是較理想的聽覺系統生后發育研究對象[5，6]，生后第14天的大鼠90 dB SPL短純音可引出ABR，隨著日齡增加，其ABR閾值明顯下降，頻率范圍由窄變寬，至生后第35天ABR閾值已與成年大鼠無異。本研究結果顯示，在生后第14天，中頻區可以記錄到穩定的腦干電位，然而，此時大鼠的聽覺頻率范圍較窄，為4～32 kHz左右；生后第16天，4～32 kHz頻率范圍內的ABR閾值穩定下降，并且向48 kHz和1、2 kHz發展，但是聽覺敏感度還很低；到生后第18天高頻區ABR反應閾明顯下降，到生后第22～26天各頻率ABR反應閾值均明顯下降，已與成年大鼠閾值無明顯差異。對于低、中、高頻聽覺發育的先后順序尚存爭議[7,8]，Ehret[9]認為大鼠聽覺最敏感的頻率最先發育，即10～20 kHz。本實驗結果與Ehret一致，大鼠最先發育的頻率在15 kHz左右。

從本研究結果看，大鼠聽敏度在26天左右已經與成年鼠無異，而時間分辨率要到第30天才發育成熟。時間分辨率發育落后于聽敏度的成熟可能的原因如下：首先可能是初級聽覺通路中的時間編碼，如時相同步(phase locking)發育較慢。時間編碼通常在外周聽覺系統發育完全后一段時間內才成熟，而且可能與其他中樞核團的成熟有關。其次，在外周聽覺系統有功能后，聽覺頻率分辨率和強度分辨率迅速增加，很快達到成年水平。因此，由于時間編碼發育速度相對落后，時間分辨率的發育成熟落后于聽敏度。在動物實驗研究中發現聽皮層(auditory cortes,AC)神經元的調諧特性和時間分辨率有很強的相關性[10]。在發育過程中，AC神經元的調諧曲線變得更為尖銳，同樣，時間分辨率發育迅速成熟。本實驗表明從14天到35天，大鼠的間隔閾值由50 ms降低到8 ms，這一時間段和AC的發育時間相一致[2]。AC在間隔測試中的作用也十分重要，破壞AC可減弱間隔探測能力[11]，但當AC功能性退化后，大鼠雖然失去對gap的探測能力，但是仍可探測短音[12]。同時，聽覺時域處理能力不僅依靠聽功能，更有神經元的整合過程。研究發現聽皮層與時間分辨率的發育有關，另外還有其他的聽覺中樞核團，例如膝狀體、上橄欖復合體、丘腦和腦干[11, 13]的參與，這些聽覺中樞尚未完全發育成熟時，對外界信號的傳入及調控能力不高，也影響時間分辨率。

本試驗結果表明在大鼠聽覺系統發育過程中，最先發育的頻段是中頻區，隨后向低頻和高頻擴展，聽敏度在大約26天左右發育成熟；伴隨著其聽覺頻率的不斷擴展，聽閾的降低，時間分辨率也逐漸成熟，大約在30天左右完成發育。

4 參考文獻

1 Leitner DS, Hammond GR,Springer CP,et al.Parameters affecting gap detection in the rat[J]. Percept Psychophys, 1993,54:395.

2 Fitch RH, Threlkeld SW, McClure MM,et al.Use of a modified prepulse inhibition paradigm to assess complex auditory discrimination in rodents[J]. Brain Res Bull, 2008,76:1.

3 Friedman JT, Peiffer AM,Clark MG,et al. Age and experience-related improvements in gap detection in the rat[J]. Brain Res Dev Brain Res, 2004,152:83.

4 Ison JR, Allen PD,Rivoli PJ,et al.The behavioral response of mice to gaps in noise depends on its spectral components and its bandwidth[J]. J Acoust Soc Am, 2005,117:3 944.

5 Sun W, Hansen A, Zhang L,et al.Neonatal nicotine exposure impairs development of auditory temporal processing[J]. Hear Res, 2008,245:58.

6 Grecova J, Bures Z, Popelar J,et al.Brief exposure of juvenile rats to noise impairs the development of the response properties of inferior colliculus neurons[J]. Eur J Neurosci, 2009,29:1 921.

7 Romand R,Ehret G.Development of tonotopy in the inferior colliculus. I. Electrophysiological mapping in house mice[J]. Brain Res Dev Brain Res, 1990,54:221.

8 Walsh EJ,McGee J.Postnatal development of auditory nerve and cochlear nucleus neuronal responses in kittens[J]. Hear Res, 1987,28:97

9 Ehret G, Marean GC,Halpin CF, et al.Development of absolute auditory thresholds in the house mouse (Mus musculus)[J]. J Am Audiol Soc, 1976,1:179.

10 Chang EF,Bao S,Imaizumi K, et al.Development of spectral and temporal response selectivity in the auditory cortex[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2005,102:16 460.

11 Kelly JB, Rooney BJ,Phillips DP.Effects of bilateral auditory cortical lesions on gap-detection thresholds in the ferret (Mustela putorius)[J]. Behav Neurosci, 1996,110:542.

12 Ison JR, O'Connor K,Bowen GP,et al.Temporal resolution of gaps in noise by the rat is lost with functional decortication[J]. Behav Neurosci, 1991,105:33.

13 Siveke I, Ewert SD,Grothe B,et al.Psychophysical and phy-siological evidence for fast binaural processing[J]. J Neurosci, 2008,28:2 043.