早期氣導聽覺剝奪對幼鼠聽覺發育的影響△

王楓 王方圓 黑任軼 劉順利 米文娟 陳陽 邱建華

動物出生后神經系統的發育與環境密切相關，研究表明，早期聲環境的改變，可對大鼠聽覺的發育產生重要影響[1,2]。改變嗅覺、視覺和聽覺系統中感覺輸入信號會影響相應系統神經網絡在形態和功能上的發育與成熟[3～5]。聽覺剝奪效應是1996 年由15位著名聽力學家組成的Eriksholm工作組討論提出，并定義為由于聲學信息的減少導致的聽覺功能逐漸下降[6]。本研究旨在觀察大鼠聽覺發育早期氣導聽覺剝奪對Corti器發育及聽力的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 實驗動物采用清潔級SD乳鼠60只，雌雄不拘，由第四軍醫大學動物實驗中心提供，隨機分為對照組和聽覺剝奪組，每組30只。聽覺剝奪組于出生后12天行雙外耳道填塞，飼養于密閉隔聲室，42天時去除填塞物，開放外耳道在正常聲音環境飼養；對照組動物在正常食水、正常聲音環境飼養。

1.2外耳道堵塞方法 SD仔鼠生后12天時行外耳道填塞，選取助聽器耳模材料，適量大小，塑形后待其半凝固，沿外耳道方向置入耳道口，有機粘合劑固定。每天觀察耳道，填塞物如有脫落，立即補填。動物較大時則以2%戊巴比妥鈉(100 mg/kg)行腹腔注射麻醉后填塞耳道，并以手術縫線縫合外耳道口，以免抓脫。

1.3聽性腦干反應檢測 分別于出生后21、28、35、42、56 d采用聽覺電生理檢測儀(Biologic，Traveler Express E，USA)對兩組大鼠行ABR檢測。

實驗動物以2%戊巴比妥鈉(100 mg/kg)行腹腔注射麻醉。聽覺剝奪組取出耳道填塞物后進行檢測。記錄電極刺入矢狀縫與兩外耳道連線交點頭皮下，參考電極放置在刺激耳后皮下，接地電極放置在大鼠尾根部皮下。交替短聲刺激，聲源距外耳孔1.0 cm，刺激間隔為0.1 ms，濾波帶通為100～2 000 Hz，掃描時間為10 ms，疊加次數512次。以剛剛出現可以辨認的波Ⅱ或波Ⅲ為標準記錄ABR反應閾。

1.4掃描電鏡標本制備 對照組和聽覺剝奪組分別于出生后42、56天各隨機抽取3只大鼠，行掃描電鏡標本制備：動物先行戊巴比妥鈉腹腔麻醉，4%多聚甲醛、1.5%戊二醛混合液灌注固定，取耳蝸在解剖顯微鏡下剝去骨殼，去除螺旋韌帶，撕去蓋膜，顯露基底膜，立即放入3%戊二醛(pH 7.2)中固定2 h，1%鋨酸后固定1 h，梯度丙酮脫水后用梯度醋酸異戊酯置換，臨界點干燥儀干燥，離子濺射儀噴金鍍膜，掃描電鏡下觀察。

1.5統計學方法 ABR檢測結果采用SPSS 13.0統計軟件進行單因素方差分析(One way ANOVA)。

2 結果

2.1ABR檢測結果 對照組大鼠聽性腦干反應閾值隨年齡增長呈下降趨勢，35、42、56天時ABR閾值均較21天時顯著下降(P<0.01)，56天時ABR閾值基本達到正常成年大鼠水平。

聽覺剝奪組大鼠35天時聽性腦干反應閾值顯著增高，42天時仍較對照組顯著增高(P<0.01)。42天后開放外耳道恢復氣導聲音刺激，至56天時聽性腦干反應閾值仍較對照組顯著增高(P<0.01)。隨年齡增長聽覺剝奪組聽性腦干反應閾值下降趨勢消失，35、42、56天的反應閾比較差異無統計學意義(P>0.05)(表1)。

2.2掃描電鏡結果 對照組大鼠耳蝸基底膜掃描電鏡觀察顯示外毛細胞纖毛排列整齊，無毛細胞缺失及纖毛排列紊亂(圖1A)。聽覺剝奪組42天時可見基底膜各類細胞表面均產生大量細小囊泡樣改變，外毛細胞纖毛末端膨大，大部分融合(圖1B)，56天時基底膜表面改變與42 d時類似，但程度稍輕(圖1C)。

表1 兩組大鼠出生后不同時間聽性腦干反應閾值

注：*與對照組21天時比較，P<0.01；# 與對照組同天齡比較，P<0.01

圖1 各組動物外毛細胞纖毛掃描電鏡結果

3 討論

大鼠生后聽力發育的“關鍵期”一般認為從第12天開始，到第30天結束[7, 8]。眾多研究表明，早期聲音信號刺激可誘導聽覺神經中樞的發育和成熟，聽覺剝奪則具有延緩大鼠上外橄欖核(lateral superior nucleus，LSO)神經元抑制性突觸發育的作用[9, 10]。Sanes等[11]研究報道，破壞出生后一周大鼠的耳蝸則可阻斷與抑制性突觸相關的軸索和樹突正常形態學再變構的過程。同樣，破壞幼年沙鼠耳蝸阻斷聲輸入也具有阻斷LSO神經元抑制性突觸和樹突的形態發育的作用[12]。然而早期氣導聽覺剝奪對Corti器發育的影響尚不清楚。

本研究在大鼠出生后12～42天聽覺發育早期對其進行氣導聽覺剝奪，觀察氣導聽覺剝奪對大鼠Corti器發育及聽力的影響，結果可見大鼠早期聽覺刺激在聽覺發育和成熟過程中起著關鍵的作用，正常對照組大鼠聽覺發育隨年齡增長逐漸成熟，聽性腦干反應閾值隨年齡增長逐步下降，56天時基本達到正常成年大鼠水平。早期氣導聽覺剝奪組大鼠35天時聽覺發育明顯受損，聽性腦干反應閾值顯著增高，42天時開放外耳道恢復氣導聲音刺激后，至56天時聽力無明顯改善。掃描電鏡可觀察到早期聽覺剝奪后大鼠耳蝸基底膜多種細胞表面產生大量細小囊泡樣改變以及外毛細胞損傷，可見人為減少聽覺發育關鍵期聲音信號的傳入，可影響Corti器毛細胞的發育，聽覺發育關鍵期過后，再給予正常聲音刺激已經不能逆轉這種影響。文中結果說明氣導聲音刺激在大鼠聽覺感受器發育過程中起著十分重要的作用。

本研究通過聽覺電生理、掃描電鏡等方法證實氣導聲音信號刺激在Corti器發育過程中具有重要的促進作用，為臨床聽覺發育異常疾病的診斷、治療和預防提供一定的理論基礎。氣導聲音信號促進Corti器正常發育的分子機制有待于進一步研究。

4 參考文獻

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8 Nakahara H, Zhang LI, Merzenich MM.Specialization of primary auditory cortex processing by sound exposure in the “critical period”[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2004,101:7 170.

9 Webster DB, Webster M. Effects of neonatal conductive hea-ring loss on brain stem auditory nuclei[J]. Ann Otol Rhinol Laryngol,1979,88:684.

10 Hassfurth B, Magnusson AK, Grothe B, et al. Sensory deprivation regulates the development of the hyperpolarization-activated current in auditory brainstem neurons[J]. Eur J Neurosci,2009,30:1 227.

11 Sanes DH, Markowitz S, Bernstein J, et al. The influence of inhibitory afferents on the development of postsynaptic dendritic arbors[J]. J Comp Neurol, 1992, 321:637.

12 Kakazu Y, Akaike N, Komiyama S, et al. Regulation of intracellular chloride by cotransporters in developing lateral superior olive neurons[J]. J Neurosci, 1999,19:2 843.